Способ получения производных неокарзиностатина

 

Изобретение относится к способу получения производных неокарзиностатина формулы БуСМА-НКС-БуСМА, где ИКС - остаток неокарзиностатина (2+), в котором один атом И:удален из каждой первичной аминогруппы в остатке аланина в N-конце НКС и в остатке лизина в 20-й позиции от 1 -конца НКС. БуСМА(1+) частично этерифицированный бутанолом сополимерный остаток стирола и малеиновой кислоты со средней мол. массой 1480-1660 и отношением мол. массы к среднечисловой мол. массе 1,10-1,18x10 , состоящий из структурных фрагментов: а)стирола.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY

-С(О)-СН-СН-С(n)ОН-, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3783009/23-04 (22) 07.08,84 (31) 145418/83 (32) 08.08.83 (33) JP (46) 30.09.88. Бюл. N- 36 (71) Курарей Ко, ЛТД, Яманоути Фармасьютикал Ко, ЛТД, Каяку Антибиотикс Рисерч Ко, ЛТД и Хироси Маеда (л) (72) Хироси Маеда, Риуносуке Канамару, Накао Исида, Тосихико Еситаке и Минору Уеда (ЗР) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Патент США Н 4182752, кл. С 08 F 8/32, опублик. 1980. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ

НЕОКАРЗИНОСТАТИНА (57) Изобретение относится к способу получения производных неокарзиностатина формулы БуСМА-НКС-БуСМА, где

НКС вЂ” остаток неокарзиностатина (2+), в котором один атом Н удален из каждой первичной аминогруппы в остатке аланина в N-конце НКС и в остатке лизина в 20-й позиции от М-конца НКС.

БуСМА(1+) — частично этерифицированный бутанолом сополимерный остаток стирола и малеиновой кислоты со сред(1И ОI!

SU„„ А3 (51)4 С 07 К 13/00, С 08 F 8/32, А 61 К 31/785 ней мол. массой 1480-1660 и отношением мол. массы к среднечислоной мол. массе 1, 10-1, 18х10, состояший из структурных фрагментов: а)стирола (2+ остатка); б) остаток малеиновой кислоты, монозтерифицированный бутанолом, в) остаток малеиновой кислоты; r) остаток формулы в которой OH-группа одной карбоксильной группы в в уцалена и этот кар боксил соединен с НКС, которые являются биологически активными соединениями. Получение целевых соединений ведут иэ НКС в водной среде с по-. рошкообразным частично этерифицированным бутанолом сополимером стирола и малеиновой кислоты при суммарной концентрации реагентов 19-30Х, состоящим из "а", "б", и остатка малеинового ангидрида (в массовом соотношении 1:(5-12). Полученную массу подвергают диализу, остаток: фильтруют через сефадекс G-75, продукт элюируют 5 мМ водным раствором бикарбоната аммония в темноте при 5-10 С со скоростью 4-6 мл/мин и лиофилизуют.

2 табл.

1428206

Изобретение относится к способу получения производных неокарэиностатина — новых биологически активных соединений, которые могут найти при- 5 менение в медицине.

Дель изобретения — получение новых производных. неокарзиностатина, менее токсичных, обладающих высокой противоопухолевой активностью при 10 внутриартериальном применении, повышенной жирорастворимостью.

На фиг. 1-8 приведены кривые, поясняющие предлагаемый способ.

Пример 1. А. Полимеризация сополимера стирола и малеинового ангидрида. 30 л кумола загружают в аппарат высокого давления с внутренним объемом 150 л, в который также подают однородный раствор, содержащий 20

3,5 кг малеинбвого ангидрида, 20 л кумола, 3,7 кг стирола и 200 r перекиси бензоила; подачу осуществляют непрерывно в течение 65 мин, одновременно смесь нагревают до 150 С. 25

После загрузки осуществляют перемешивание в течение 60 мин при 150ОС, реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, затем в нее добавляют 30 л н-гексана, чтобы обра- 30 зованный полимер выпал в осадок, жидкую фазу сливают, получая таким образом осажденный полимер. После измельчения полимера его промывают н-гексаном,а затем сушат. Выход полученного полимера составил 7,3 кг.

Среднечисловой молекулярный вес (Мч) полимера, измеренный при помощи осмометрии давление пара (ОДП), составил 1680 ° Он согласуется с измере- 40 ниями ЯМР-спектроскопии, которые также показывают, что полученньпФ таким образом полимер является сополимером стирола и малеинового ангидрида в молярном отношении 1:1 (фиг.1). 45

Б. Фракционирование сополимера стирола и малеинового ангидрида.

40 r сополимера стирола и малеинового ангидрида (СМА), полученного на стадии А, растворяют в 1,4 л ацетона, в раствор добавляют 3,8 кг стеклянных шариков (средний размер частиц О, 1 мм), поверхность которых предварительно обрабатывают с исполь55 зованием соединительного агента силана. Затем ацетон выпаривают, чтобы осадить СМА на поверхностях стеклянных шариков.

Стеклянные шарики с осажденным СМА и 1,4 л смешанного растворителя ацетона и н-гексана (объемное отношение составляет 8:92 при 25 С) загружают в колонну, имеющую внутренний диаметр

80 мм и длину 80 см, при этом температуру системы поддерживают на о уровне 25 С, а затем последовательно подают три типа смешанных растворителей ацетона и н-гексана (такими о смешанными растворителями при 25 С являются 0,6 л смеси в отношении

8:92, 3,0 л смеси в отношении 22:78 3 0 л смеси в отношении 34:66, растворители подаются в указанном порядке), при этом жидкость вытекает из нижнего выпускного отверстия колонны. Элюат, полученный при применении смешанного растворителя ацетона и н-гексана с объемным отношением

34:66, концентрируют и сушат при пониженном давлении, в результате чего получают пробу в 6,3 г. Эту пробу,, подвергают гельпроникающей хроматографии (ГПХ) средневесовой молекулярный вес (Мв) составил 1350, а среднечисловой молекулярный вес (Мч)

1170 (Йв/Мч = 1,16). Согласно методу ОДП Яч составляет 1170.

В. Частичная полу-н-бутил-зтерификация фракционированного СМА.

6,0 r СМА, полученного на стадии

Б. 1,95 r н-бутилового спирта, 15 мл диоксана и 0,06 r ацетата лития помещают в стеклянную пробирку, затем пробирку закрывают и с целью получения однородного раствора встряхивают в течение 24 ч при комнатной температуре. Затем этот раствор выдержио вают при 90 С в течение 17 ч и охлаждают до комнатной температуры. Далее реакционную жидкость сливают. Слитую реакционную жидкость разбавляют двукратным объемом диоксана и подвергают лиофилизации, затем полученный продукт сушат под вакуумом с целью получения материала в виде светложелтоватых хлопьев, которые растирают и получают 7,8 r порошка. Инфракрасный спектр поглощения получен методом порошкообразного ). KBr. Он подтвердил через оптические плотности с волновым числом 1780 и 700 см что полученным порошком является частично полу-н-бутил-этерифицированный сополимер стирола и малеинового ангидрида (БуСМА), в котором содер- жание оставшихся колец малеинового

3 14282 ангидрида составляет 30,5 мол.X (колец иалеинового ангидрида в одной молекуле 1,7), Согласно ГПХ Йв составляет 1480, Яч — 1290, а Ив/Мч равно 1.15.

Г. Реакция НКС с БуСМА.

0,20 r неокарзиностатина (НКС) растворяют в 5 0 мл 0,8 М водного раствора бикарбоната натрия при охлаждении льдом в темноте. В раствор порциями добавляют порошкообразный

БУСИА в количестве 1,02 r. Далее реакцию осуществляют в течение 97 ч, при этом рН раствора поддерживают на 15 уровне примерно 8,5, чтобы получить степень превращения первичных аминогрупп НКС 97,5 мол.X. Степень превращения таких первичных аминогрупп может быть определена методом "ТНБС 1, 20 в соответствии с которым небольшое количество пробы, взятой из реакционной жидкости, разбавляют, а затем осуществляют взаимодействие этой пробы с тринитробензол(моно)сульфо- 26 кислотой с целью получения производного нитробенэола, который определяется на основе количества первичных аминогрупп спектрофотометрически с использованием спектрометра поглоще- 30 ния в диапазоне 420 нм.

Полученную реакционную смесь переносят в трубку для диализа (фирма Юнион Карбайд Ко, Лтд США), которая отсекает молекулярные веса 35

8000, при этом диализ осуществляют в течение трех дней против водного

5 мМ раствора бикарбоната аммония при охлаждении льдом в темноте, одновременно иногда заменяют внешний 40 слой жидкости.

Часть частично очищенного раствора разбавляют при помощи 10 мМ водного раствора бикарбоната аммония,, чтобы обеспечить рН 7,9. Снятые ГПХ" кривые получены с использованием колонны 1-3000 СУ, производимой фирмой

Тойо. Сода Уо Отд. Пики (фиг.2а,б) при времени удерживания 16 мин при длинах волн 254 и 280 нм имеют максимумы, примерно равные друг другу и связаны с производными формулы (I), в то время как поглощение при времени удерживания 19 мии в .диапазоне

254 нм связано только с гидролизованным и с разорванным кольцом продуктом БуСМА.

Д. Очистки НКС-производных формулы (I).

06

Полонину количества диализированной реакционной жидкости сливают в колонну, имеющую внутренний диаметр

50 мм, длину 60 см (К 50/60, фирма

Фармациа Фаин Кеминэлз АБ„ Уппсала, Швеция) и заполненную субстратом

Сефадекс G-75, а злюирование осуществляют с объемной скоростью 6,0 мл/

/мин при 10 С в темноте при помощи

5 мМ водного раствора бикарбоната аммония. Непрерывно осуществляют измерение поглощения элюата в диапазоне с длиной волны 254 нм (фиг. 3), Фракцию элюата с 60 по 100 мин после введения пробы прдвергают затем лиофилизации. Эту процедуру повторяют при тех же условиях. Полученные очищенные НКС-производные. (I) имеют общий вес 186 мг.

При проведении электрофореэа с использованием полиакриламидного геля, содержащего додецилсульфат натрия, полученное НКС-производное дает одно пятно. Как показано на фиг. 4а, ГПХ получен при рН 7,9 с использовйнием колонны 1-3000 СУ, производимой фирмой Тойо Сода Ко., Лтд, и подвижной фазой — 10 мИ водным раствором бикарбоната аммония, имеет острый пик., Элементарный анализ, вес.Ж: N

i1,43; С 51,99; Н 6,32.

Средний молекулярный вес НКС-производного в пересчете на содержание азота составил 13300. Средний молекулярный вес рассчитывался по следуницей формуле:

Md = Мй 1чй/М(а, где Md — средний молекулярный вес

НКС-производного;

Мк — молекулярный вес НКС, равный 10700, Ин — содержание азота в соответ" ствии с элементарным анализом НКС, 14,24 вес.Ж;

Nd — содержание азота (вес.Х) в соответствии с элементарным анализом НКС-производного.

Средний молекулярный вес НКС-производного, имеющего формулу (I),составляет 10700 + 1480 х 2 13660 в пересчете на средневесовой молекулярный вес Е-СМА (1480), полученный при помощи ГПХ. Так как указанный средний молекулярный вес в пересчете на содержание азота согласуется с этим значением, можно представить,.

5 14282 что .в полученном НКС-производном два остатка частично полуэтерифицированных остатков сополимера стирола и малеиновой кислоты связаны с одним остатком НКС, как показано в формуле (I). Средний молекулярный вес (Мч) частично полуэтерифицированного остатка сополимера стирола и малеиновой кислоты, содержащегося в НКС-производном, определяется из среднего 10 молекулярного веса НКС-производных, определенных по следующей формуле:

МГ - (Мы. — Мн)/29

15 где Mr. — средний молекулярный вес частично полуэтерифицированного остатка сополимера стирола и малеиновой кислоты в НКС-производном; 20

Й вЂ” средний молекулярный вес

НКС-производного;

Ин -.молекулярный вес НКС (10700).

Согласно этой формулы Mr равен 25

1300. Это значение не очень отличается от средневесового молекулярного веса исходного материала Е-СМА, который равен 1480 и получен при помощи

ГПХ. 30

Соединение не имеет явно выраженных точек плавления, (ос) — 34,3

ИК и УФ-спектры подтверждают структуру НКС-производного формулы (I), являющегося предметом изобрете ния (фиг. 5а и ба).

Пример 2. Фракционированный

CMA с Ив 1480 и Мч 1230 (Мв/Йч

1,20) получают при помощи процедуры, аналогичной в примере 1, за тем исключением, что смешанный растворитепь ацетона и н-гексана в отношении

38 62 используют в качестве третьей смешанной жидкости ацетона и н-гек45 сана при фракционировании СИА, полученного в примере 1А. 4,0 r фракционированного CMA подвергают этерификации при тех же условиях, что в примере 1В, за исключением того, что при этом используют 0,80 r этанола, 12 мл диоксана и 40 мг ацетата лития.

В результате было получено 4,9 r частично полу-этил-этерифицированного сополимера стирола и малеинового ангидрида (сокращенно именуемого

ЭтСИА), содержание колец ангидрида в котором составляет 24,0 мол, (в среднем 1,6 колец ангидрида на одну

06 6 молекулу). Йв = 1580 и Ич = 1340 (Йв/Йч = 1,18)..

По аналогии с примером 1Г 0,2 r

НКС растворяют в 5 0 мл 0,8 И водного раствора бикарбоната натрия, 1,2 r

ЭтСИА добавляют порциями в полученный раствор. В течение .этой реакции рН раствора поддерживают на уровне примерно 8,5. Спустя 27 ч после начала добавления степень превращения первичных аминогрупп составила

97,5 мол. . Сразу после этого реакционную жидкость подвергают диализу, а.38 мл диализата подвергают гелевой фильтрации. Затем фильтрат подвергают .лиофилизации, в результате чего получают 148 мг очищенного НКС-производного формулы (I).

При электрофорезе полученное НКСпроизводное дает одно пятно, ГПХ приведена на фиг, 46. Элементарный анализ, вес, .: N 10,74; С 52,90;

Н 6,18. Средний молекулярный вес в пересчете на эти данные составляет

14200, а средний молекулярный вес частично полу-этил-этерифицированного остатка сополимера стирола и малеиновой кислоты составляет 1750.

Сняты УФ- и ИК-спектры (фиг. 56 и

66). Эти данные подтверждают структуру НКС-производного, являющегося предметом изобретения, которая описЫ вается формулой (I)

Пример 3. СМА, полученный в примере 1А, подвергают фракционированию с использованием метода, описанного в примере 1В, за исключением того, что объемная фракция ацетона во второй и третьей смешанных жидкостях ацетона и н-гексана составляет

23 и 37 соответственно, в результате чего получают 9, 1 г фракционированного СИА с Мв = 1480, Мч = 1250 (Мч = 1230 при определении методом

ОДП), а Мв/Йч = 1, 18. 4,0 г полученного фракционированного СИА взаимодействует, как в примере 1В с использованием 1,60 г моноалкилового эфира этиленгликоля в качестве спирта и 0,04 r ацетата лития. В результате получают 4,9 r частично полу-2-этоксиэтил-этерифицированного сополимера стирола и малеинового ангидрида (сокращенно именуемого Эт-Селл-CMA), содержание колец ангидрида в котором составляет 25,4 мол. % (в среднем

1,6 колец ангидрида на одну молекулу). Мв = 1700 и Мч = 1440 (Мв/Мч

1, 19) .

1428206

По аналогии с примером 1Г ЭтСелл-CMA добавляют и растворяют порциями с общим количеством 1,3 r в

5,0 мл 0,8 М водного раствора бикарбоната натрия, в котором было предварительно растворено 0,2 r НКС. Поддерживая РН раствора на уровне примерно 8,5, осуществляют взаимоцействие. Спустя 98 ч после начала добавления Эт-Селл-СМА степень превращения аминогрупп составила 97,6 мол.7. Полученную таким образом реакционную смесь подвергают диализу, гелевой фильтрации и лиофилизации. В результате получают 189 мг очищенного HKCпроизводного (I).

При электрофорезе полученного НКСпроизводного наблюдают одно пятно.

ГПХ приведена на фиг. 4в. Данные эле- 20 ментарного анализа, вес. Ж: N 10,72, С 53,49; Н 6,38. Средний молекулярный вес в пересчете на эти данные составляют 14200, а средний молекулярный вес частично полу-2-этоксиэтил-этерифицированного остатка сополимера стирола и малеиновой кислоты—

1750. Сняты УФ- и ИК-спектры (фиг.5в, бв). Эти данные подтверждают структуру HKC-производного формулы (I), 30 являющегося предметом изобретения (фиг. 4г, 5г, бг) .

Пример 4. Фракционированный

CMA сМв 1480 и Мч 1230 (Мв/Мч 1,2) приготовлен по методике примера 1, за.исключением того, что в качестве третьей смешанной жидкости ацетона и н-гексана в фракционирующем СМА, полученном в примере 1, используют смешанный раствор ацетона и н-гекса40 на в соотношении 38:62.

6,0 гфракционированного СМА подвергают частичной полуэтерификации с использованием 1,60 г н-бутилового спирта, 16 мл диоксана и 0,06 г аце- 45 тата лития. В результате получают

6,3 БУСМА, содержание колец ангидрида в котором составляет 44,4 мол.7, (в среднем 2,8 кольца ангидрида на одну молекулу). Мв составляет 1660, а Ni — 1390 (Мв/Йч = 1,18). Полученный таким образом БУСМА взаимодействует в течение 70 ч, как в примере

1Г,.в результате чего получают степень превращения первичного амина в

НКС 99,3 мол.X. Продукт подвергают

S5 диализу, гелевой фильтрации и лиофилизации. В результате получают

182 мг очищенного НКС-производного формулы (I) . Данные элементарного анализа, вес, Е: N 10,67; С 52,06;

Н 6,22. Средний молекулярный ве" равен 14300, а средний молекулярный вес частиччо полу-н-бутил-этерифицированного остатка сополимера стирола и малеиновой кислоты равен 1800, Гь .) "а — 33, 8

Пример 5. ФракционировАнный

СМА подвергают частичной голу-метилзтерификации с метанолом, в результате чего получают частично полу-метил-этерифицированный сополимер стирола и малеинового ангидрида (сокраценно именуемый МеСМА), содержание колец ангидрида в котором составляет 35 0 мол.Х (в среднем это содегжание составляет 1,7 колец ангидрида на одну молекулу), Мв =- 1510 и Мч

1280 (Мв/Йч = 1, 18). Получечный таким образом МеСМА взаимодействует с

НКС, затем осуществляют очистку по аналогии с примером 2 и выделяют соответствующее НКС-производное формулы (I) . Получают следующие да ;ные элементарного анализа, вес. : N

10,87; С 52„81 Н 6,11. Средний молекулярный вес составляет 14000, а средний молекулярный вес части.но полу-метил-этерифицированного остатка сополимера стирода H мачеиновой кислоты — 1650.

Пример б. Фракционированный

СМА подвергают -.астичной этерификации с использованием 1,3-диэтокси-2-пропанола, в результате чего получают частично полу-1-(атоксиметил) -2-

-этоксиэтил"этерифицированный сополимер стирола и малеинового ангидрида,содержание колец ангидрида в котором составляет 25,3 мол.Х (в средней 1,6 колец" ангидрида ча одну молекулу), Мв = 1960, Мч -- 1650 (Йв/Мч 1, 19).

Полученный таким образом сополимер взаимодействует с НКС. Затем полученный продукт очищают по примеру 3, чтобы выделить соответствулцее производное HKC дюрмулы (I). Данные элементарного aíàëèçà, aec.X: N

10,2, С 53,58; H 6 51. Средний молекулярный вес равен 14900, а аналогичный показатель для частично полу-1-(этоксиметил)-2-этоксизтил-этерифицированного остатка соголимера стирола и малеиновой кислоты — 2100.

П р и и е р 7. HKC-производное формулы (I) получают в соответствии с описанной процедурой используя

1428206

БуСМА (Мв 1620 Йв/Мч = > 10), который был получен предварительно при условиях, аналогичных в примере 1А1В, за исключением того, что перекись 5 дикуменила используют в качестве катализатора полимеризации вместо пе рекиси бензоила.

После того, как 0,67 r НКС растворяют в 20 мл .: 0,8 M водного раст-10 вора бикарбоната натрия при охлаждении льдом и без доступа света, в полученный раствор добавляют порциями всего 8,00 r БуСМА при перемешивании, затем реакцию осуществляют в течение 15

50 ч, при этом рН реакции поддерживают на уровне более 8,,3. Степень превращения первичных аминогрупп НКС составляет 97,8 мол.Ж (общая концентрация НКС и БуСМА 30%). 20

Полученную реакционную смесь разбавляют водой до объема 90 мл, а затем сливают в колонну, имеющую внутренний диаметр 50 мм и длину 90 см, заполненную субстратом Сефадекс С-75 25 (фирма Фармация Файн Кемикэлз АБ, Уппсала, Швеция). Элюирование осуществляют с объемной скоростью

4,0 мл/мин в темноте при 5 С с использованием 5 мМ водного раствора 30 бикарбоната аммония в качестве несущего растворителя. По аналогии с примером 1 одновременно с получением спектра поглощения элюата в диапазоне с длиной волны 254 нм собирают фрак- 35 цию элюата с 1 2/3 ч по 6 2/3 ч после введения пробы. Объем этой фракции составляет 1050 мл. Ее концентрируют до объема 60 мл с использованием мембранного ультрафильтра 6М 14539 40 (фирма Сарториус БмгХ, Западная Германия: отсекается молекулярный вес

10000) (фиг. 7).

Одну половину концентрированной жидкой фракции, а именно 30 мл,наносят на колонну диаметром 50 мм и длиной 60 см, заполненную субстратом

Биогель P-60 (фирма Био-Рэд Лабораториз, США), элюирование осуществляют с объемной скоростью 1,2 мл/мин в темноте с использованием 5 мМ водно50

rî раствора бикарбоната аммония. Собирают фракцию элюата с 12 3/4 по

16 1/12 ч после введения пробы, а концентрацию осуществляют с исполь-: зованием мембранной ультрафильтрации, 55 затем проводят лиофилизацию. Выход очищенного продукта, НКС-производно го формулы (I), составляет 266,5 мг.

В результате элементарного анализа были получены следукщие данные для производного, вес.Ж: N 11,31; С 52,97, Н 6,40. Средний молекулярный вес составил 13,470, а средний молекулярный вес частично полу-бутил-этерифицированного сополимера стирола и малеиновой кислоты — 1,385 t +J» -34,3

Проведены биологические испытания производных неокарзиностатина.

Биологическая активность была из-- мерена для каждого из НКС-производных, полученных в примере 1. Порции в двадцать мл НКО-производного, имеющие различные концентрации, помещают на бумажный диск диаметром 8 мм, который помещают на агаровую пластинку с культуральной средой (Мюлер-Хинтон), на которую предварительно прививают штамм Sarcina lutea PCI 1001.

Спустя некоторое время, необходимое для диффузии (5 ч) при 4 С культивио рование возобновляют при 37 С в течение 12 ч. При этом определяют концентрацию разбавленного раствора, необходимую для получения диаметра ингибирования в 13 мм. Такую эффективную концентрацию НКС обозначают через " 1", а определенные концентрации НКС-производных приводятся в виде относительных значений в пересчете на значение 1 НКС. Полученные относительные значения используют в качестве показателя биологической активности.

Что касается острой токсичности относительно мышей, то разбавленный раствор применяют один раз внутривенно путем введения раствора в хвост самца мьппи ICR (одна группа — 6 мышей) в возрасте 5-6 недель, затем за упомянутыми мьппами наблюдают в течение 14 дней для определения величины ЛДпо

Данные относительно биологического анализа с использованием штамма lutea и острой токсичности приведены в табл. 1. Из полученных результатов видно, что НКС-производные, получаемые в условиях предлагаемого способа, обладают биологической активностью, сравнимой с биологической активностью НКС, но острая токсичность первого гораздо ниже. На фиг. 8 приведена кривая инактивации, полученная при помощи изменения остаточной биологической активности против lutea

НКС-производного.

I 428206

Таблица.

Пример

4,63

1,41

Ъ

5,54

1,24

3i20

Контрольный

НКС

1 33

Т а б.л и ц а 2

НКС-производное по примеру 1

2,0

О/8

1,0

2/8

56,2

0,5

40,5

7/8

0,25

8/8

3i 1

О, 125

7,4

8/8

0,4

НКС

3/8

41,0

34,8

0,2

7/8

8/8

0,1

16,9

0,05

8/8

3,6

При инкубировании НКС-производного формулы (I) против lutea в концентрации 100 мг/мл в свежей крови о., человека при температуре 37 С обнаружено, что время потери половины активности в цельной крови составляет

32 мин и 8 мин для НКС-производных, полученных в приведенных примерах.

Аналогичный показатель для НКС, кото рый используют в качестве контрольного соединения, составил 2-3 мин.

Следовательно, НКС-производные, полученные в условиях предлагаемого способа, являются намного более стабиль-,15 ными в том, что касается их биологической активности в цельной крови или сыворотке по сравнению с исходным

НКС.

Кроме того, определяют с использованием НКС-производного из примера t противоопухолевую активность против карциномы Эрлиха (твердого типа).

Полученные результаты приведены в 2с табл. 2. НКС-производное, полученное по предлагаемому способу, обладает противоопухолевой активностью, равной

-активности НКС.

П р и м е ч а н и е ° 1. Используют штамм Sarcina lutea PCI-1001 °

2. Концентрация, при которой зона ингибирования имеет диаметр 13 мм на

D агаровой пластинке, указана в виде относительного значения, при этом соответствующую концентрацию НКС принимают в качестве стандарта.

1 4 ?8206

Опухоль: Карцинома Эрлиха (твердый тип), Привитое количество клеток: 5 х х 10 /мышь (подкожным способом).

Мыши: ddY возраст — пять недель.

Применение препарата: внутрибрюшинным способом - один раэ в день (всего 5 раз): в 1, 2, 4, 5 н 6-й день после трансплантации опухоли.

Оценка действия препарата: скорость ингибирования опухоли (%) равна

/С-Т/х10О/С, где С вЂ” средний размер опухоли (мм ) в контрольной группе, Т вЂ” средний размер опухоли (мм ) в т обработанной группе.

Оценка скорости ингибирования опухоли была получена в конце второй недели после трансплантации опухоли °

Долю выживших мышей подсчитывают через 4 недели после трансплантации опухоли. !

Производные неокарзиностатина общей формулы (Т) обладают высокой жирорастворимостью (в липйдоле), в то время как неокарзиностатин и его известные производные растворяются только в воде.

Таким образом, получаемые предлагаемым способом производные неокарзиностатина менее токсичны, чем неокарзиностатин, обладают сравнимой биологической активностью, в 4 раза дольше сохраняют свою биологическую активность, чем неокарзиностатин, при этом обладают способностью растворяться в воде.

Формула изобретения

Способ получения производных неокарзиностатина общей формулы (I)

БуСМА — HKC — БуСМА, где HKC — двухвалентный остаток неокарзиностатина, в котором один атом водорода удален из каждой первичной аминогруппы в остатке аланина в

N-конце неокарзиностатина и в остатке лизина в 20-й позиции от N-конца неокарзиностатина;

БуСМА одновалентный частично эте- 55 рифицированный бутанолом сополимерный остаток стиро-. ла и малеиновой кислоты, имеюший средний молекулярный вес ГЬ 1480-1660 и отношение Мв к среднечисловому молекулярному весу Мч 1, 10-1, 18 !!в и состоящий из следующих структурных блоков: остаток стирола

СН2 СН частично этерифицированный бутанолом остаток малеиновой кислоты — — снI

СООС 4i9 СООН остаток маленковой кислоты — СН СН—

СООН СООН остаток формулы — CH — CH—

О= С СООН

1 где гидроксильная группа одной карбоксильной группы остатка малеиновой кислоты удалена и этот карбоксил соединен с неокарэиностатином, о т л ич а ю шийся тем, что проводят реакцию неокарзиностатина в водной среде с порошкообраэным частично этерифицированным бутанолом сополимером стиролаи малеинового ангидрида, состоящего из структурных блоков остатка стирола

-СН2- Сн— частично этерифицированного бутанолом остатка малеиновой кислоты — СИ CH—

1 1

СООС@9 СООН

16! 428206

15 — СН вЂ” СН—

1 I

С С

Q О О

Ф

6 „5 Ф „д Г

Хв учсский сйца Фпад на миллион) 10 Е2 14 5 18 Ю 32ЯФ 28 28 Ю а 1Ф g и 20 а г

ВРеня удермибания(мин) 8реня уберяибания{нин) Фиг Я

И 100 юа ареня уберкибания (нин )

Фиг. Х и остатка малеинового ангидрида взятым в массовом соотношении 1:512 при суммарной концентрации неокарзиностатина и частично этерифицированного бутанолом сополимера. стирола и малеиновой кислоты 19-30Х затем реакционную массу подвергают диализу, остаток фильтруют через сефадекс G-75 или биогель Р-60, продукт элюируют 5 мМ водным раствором бикарбоната аммония в темноте rlpH

5-10 С со скоростью 4-6 мл/мин и лиофилизуют.

l428206 ю ур ()

rZ N lб И 202224 время убержи3аиия(мин ) .

® ra Zd22 Д

iz н и is zs zz zs ггггд юг м is is zo гг и zs гв бггня 1тмигонця(нон) ггг " гггни уггреогпноя(пцн) д Фое.4 3

Ю 74 Тб 1В 20 22 24 ПоелоЩение

88М нм Ч Ц и и 2О 22 2 « удеркибания(иин J .

Г

Время уМрми3ония (иин ) . 5рюкя уМжи5ания(тк)

14 16 0 П0е И 10 16 18 8022 24 26 О

l 428206

1 ь

QC» ОО ф20

hS аЕО

0 ИОО 2000 1600 М0 Ж 500

ИО 2>00

Волновое числа (err- )

ИВ аОО ВОО 500

Волновое число фп -ь

ЛОО 2400 е ь ВО

4а Q

-ЬK

Ь%

Е 20 с Ъ

М бйО

О МОЦ 2000 Mme ИИ ООО ЛЮ

ЛОО ДОО

Волнодое число (си-

<э Q о ФО з ф 20 1

6 0

0 2000 ЛЮО ах тО Ю 500

ЛОО 2ЙЮ Волновое числе(гн

Фиа. 5

1428206

„ t,0 w ОЯ

< 0,8

1 07 06 0Х 0P

03 з 02

< о а 0

5 nm гг N0 йЮ

Юолни (нн)

Фце. 6

240 280 Ид 360400

Юлина Ипны (нм) то

Ф.э

w О,S 08

< 07 с 0,8 ь05 у 1

%0

Щ °

„о,з

Ъ 0,2 ф-. 1

å L01 с

Д И0,240 880 Ю

ДПина

w 1,0 Ю ф 1 + 09

1 0,8 ь07

+ 4Об у 05

ОР

ОО 03

Ф 02

Е: 01

ЮО 240 280 820 И0 ФИ

Дпина dNPw(treJ

Å B1,0 г

w0,9

Q 1 < 0,8 ь0,7 ь 0,6

Ю0,$ 0,3 ю 02

Ф 1

Е 0,1 гоа 240 280 Зг0 ЮВ0 Е

Длина челны,(нн) !

42820б

100

0.1

И 60 75 90

Врезке инактобоцци (prupi ) 15

Фив. 8

Редактор М. Петрова

Заказ 4870/59 Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 10 ь

Ь

ü 1

«э

Зо

«ь Q р « В

« Ъ

« ь

Ь, Cb

% :

10 12 14 Я 18 20 22 24

ВРсня ууюЮнцяания (ти. j

Составитель В.Волкова

Техред А.Кравчук Корректор С Черни