Способ определения глутамат-пирувати глутамат- оксалоацетаттрансаминазы

 

Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - повьшение точности способа. Получают пируват или оксалоацетат при трансаминирова- . НИИ с6-кетоглутаровой кислоты. При этом используют D-лактатдегидрогеназу из ряда бактерий или мелатдегидрогеназу. Затем производят восстановление до лактата или малата в присутствии никотинамиддинуклеотида восстановленного . Измеряют в полученной смеси количество образовавшегося никотинамидаденина окисленного.Способ может быть использован для диагностики заболеваний печении сердца. 6 табл. §

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (1Ю (И) (д) 4 G Ol И 33/48 С 12 g 1/52

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цц, И flATEHTY (21) 3784992/28-14 (22) 21.08.84 (31) P 3330246.4 (32) 22.08.83 (33) .DE (46) 15.10.88. Бюл. У 38 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DE) (72) Геральд Меллер (DE) (53) 612.015(088.8) (56) Патент США 1(4235962, кл. С 12 Q 1/52, 1980. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛУТАИАТ-ПИРУВАТ- И ГЛУТАМАТ-ОКСАЛОАЦЕТАТТРАНСАМИНАЗЫ (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — повышение точности способа. Получают пируват или оксалоацетат при трансаминировании о,-кетоглутаровой кислоты. При этом используют D-лактатдегидрогеназу из ряда бактерий или мелатдегидрогеназу. Затем производят восстановление до лактата или малата в присутствии никотинамиддинуклеотида восстановленного. Измеряют в полученной смеси количество образовавшегося никотинами даденина окисленного. Способ может быть использован для диагностики заболеваний печении сердца. 6 табл.

1431690

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинике при распознавании болезней печени и средца.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается тем, что согласно способу определения, включающем вза,имодействие соответствующей аминокис- 1О лоты сна-кетоглутаровой кислотой до получения глутаровой кислоты и о -кето кислоты, соответствующей используемой кислоте, и измерение образовавшейся

eL-кетокислоты в результате восстанов- 15 ,пения с NADH в присутствии лактатдегидрогеназы и в соответствующем слу чае малатдегидрогеназы при образова,нии NAD и ь -оксикислоты, используют

D-лактатдегидрогеназу из ряда бакте- 20 рии °

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение GPTактивности (вариант с фосфатным буфе" 25 ром) .

Материалы пробы: сыворотка, плазма гепарина или EDTA.

Реагенты (конечные пробы в тесте): фосфатный буфер 80 ммоль/л с рН = 7,4,30

L-алании 800 ммоль/л, DH из DSM 2699 1200 О/л, NADH 0,18 ммоль/л, ;кетоглутарат 18,0 ммоль/л.

Определительная насадка: длина вол Hg 365, 340 или 334 нм, кювета: толщина слоя 1 см, температура изо йерения 25 С, измерение по отноше,нию к воздуху (уменьшение экстинкции)

В фотометре при аналогичных показаниях начальная .экстинкция1 выше 40

0,500 компенсируется каскадным регулированием, В кювету вносят пипеткой 2,5 мл реакционной смеси и 0,5 мл пробы и смешивают. Приблизительно через 1 мин 45 снимают показания экстинкции и одновременно включают секундомер. Снимают показания через 1,2 и 3 мин.

При разнице экстинкции в минуту (дЕ/мин) от 0,06 до 0,08 (Hg 365) или 0,11-0,18 (Hg 334 и 340 нм) принимают во внимание лишь измерения первых двух минут (1 мин инкубиру1 ют и 2 мин измеряют) .

Из разницы . экстинкпии! в мину у (дЕ/мин) получают среднее значение и его используют при расчетах.

Активность GPT в пробе рассчитывают следующим образом:

U/ë (25 С) = 1765 ЬЕ 6 нм/мин

Ил (25 С) = 952 х д Е, нм/мин, U/ë (25ОС) = 971 " ЬЕ нм/мин

Пример 2 ° Определение GOTактивности (вариант с трис-буфером)>

Материал пробы: сыворотка, плазма гепарина или EDTA.

Реагенты (конечная концентрация в тесте): трис-буфер 100 ммоль/л с рН 7,5, NADH 0,18 ммоль/л, MDH 600 U/ë, LDH из DSM 2694 1 200 U/ë, (а -кетоглутарат 1 2 ммоль/л, L-аспартат

200 ммоль/л.

Определительная насадка: длина волны Hg 365, 340 или 334 нм, кювета: толщина слоя 1 см, температура о измерения 25 С, измерение по отношению к воздуху (снижение экстинкции) °

Смешивают 2,5 мл раствора реагента с 0,5 мл пробы, раствор заливают в кювету. Через 1 мин снимают показания экстинкции и одновременно включают секундомер. Дальнейшие показания снимают через 1,2 и 3 мин °

Из разницы экстинкции в минуту (дЕ/мин) получают среднее значение и его используют для расчетов.

Активность GOT в пробе берут из таблицы или рассчитывают следующим образом:

U/л (25 С) = 2059 < ДЕ нм/мин; . !

1/л (25ОС) = 1111 " ДЕ q4o нм/мин;

U/ë (25 С) = 1138 A Е < нм/мин ° а

Как показали исследования при 25 С в случае использования известного реагента приблизительно через 34 ч весь

NADH исчезает, в то время как в случае использования предлагаемого реагента даже через 120 ч получают око-! ло 71Х начальной экстинкции . При

4 С и времени хранения !20 ч для известного реагента — 30K остаточной экстинкции „ а для предлагаемого—

90 .

Пример 3. Получение D-ЛДГ.

Получают по способу, описанному в Т.of General Microbiology (1970)

62, 243.

Для этого анаэробно культивируют

Lactobacillus leichmannii М 2699 в ферментаторе вместимостью 10 л при

37 С с пропусканием газов (957 И

57 CO ). В качестве среды применяется среда, описанная в J. of General

Microbiology 62, (1970), 223-239, з

4 причем дополнительно добавляют ацетат объему и отделяют осадок центрифуги-, натрия 0,05 вес.% и цитрат диаммония рованием.

0,02 вес. . Доводят рН остатка до 7, и полуВ конце экспоненциальной фазы ро- чают выделяющуюся фракцию насыщен5

Э ста бактерии собирают, промывают в ную до 50-80 сульфатом аммония. Эту

0,05 М буферного раствора фосфата фракцию хроматографируют через слабый калия с рН 7, и вновь суспендируют анионит (ДЕАŠ— Sephadex®А50) в в том же буферном растворе. Затем 0,05 М буферного раствора фосфата ультразвуковым прибором Вау Ьеоп 11 КС 10 калия (рН 7,0) и элюируют градиенпроизводится клеточное разложение. том NaC1 (0,5-1,0 моль/л) о

Затем центрифугируют при 4 С в те- Получают препарат ЛДГ (выход около чение 30 мин при 15000 g. Доводят 25 ) . рН полученного в виде остатка сыро- Пример 4. Таким же обраго экстракта микроорганизма с помо- i5 зом, как и описано в примере 3, полущью уксусной кислоты до 5,5, разбав- чают D-ЛДГ из других штаммов семейств. ляют сульфатом протамина до 0,3 по Lactobacillus и Leuconostoc, выход, Х:

Lactobacillus lactis DSM 20072

Lactobacillus plantarum

DSM 20174

Leuconostoc mesentегоides

DSM 20193

Примерно 20

15

Пример 5. Получение Р-ЛДГ из, Pediococcus pentosaceus M 20280.

Pediococcus pentosaceus культивируют в MRS-среде с I глюкозы в ферментере емкостью 10 л без аэрации.

Собраннь3е путем центрифугирования клетки промывают с помощью 0,9 вес.Еного раствора NaC1 и суспендируют в

0,05 моль/л натрийфосфатного буфера который содержит 0,002 моль/л DTT u

0,002 моль/л DL-лактата натрия. Растворение происходит в гомогенизаторе клеток Брауна при охлаждении. После декантации жидкости ее в течение

30 мин при 4 С центрифугируют при

37000 g. Прозрачную надосадочную жидкость подвергают фракционному осаждению сульфатом аммония, причем фракция осаждается при насыщении 40-70 . Эту фракцию, растворенную в 0 05 моль/л натрийфосфатного буфера и 0,002 моль/л DTT, хроматографируют гри соответствующих условиях через колонку с сефарозой 6В.

В D-ЛДГ-фракциях путем концентрирования и разбавления с помощью

0 05 моль/л трис-буфера, который содержит. 0,002 моль/л ДТТ и

0,05 моль/л ИаС1, устанавливают рН 8 и хроматографируют через колонку с ДЕАЕ-сефадексом. Элюирование осуществляют с помощью линейных градиентов 0,05-0,5 моль/л NaC1.

Выход примерно 10%, 25 Пример 6. Определение активности GPT.

Материал для испытания: сыворотка, гепарин или плазма EDTA.

В качестве реактива применяют

30 раствор следующих веществ (фирма

"Берингер Маннхайм"), г:

NaH2РО4 1,47

Na НР04 13,49

oL-аланина 99,7

D-ЛДГ из Lactobacillus

leichmannii, DSM 26990,037

NADH 0,163 -Кетоглютарат 2,042

40 Вода 1 л

2,5 мл этого реактива перемешио вают при 25 С с 0 5 мл пробы и определяют активность GPT, как описано в примерь 1.

45 Конечные значения концентрации добавленных веществ в опыте соответствуют данным в примере 1.

Пример 7. Одинаковые с примером 4 результаты получают, если вместо 0,037 r D-ЛДГ из Lactobacillus

leichmannii DSM 2699 применяют 0,048 r

D-ЛДГ из Lactobacillus lactis DSM

20072; 0,035 г D-ЛДГ из Lactobacillus plantarum DSM 20174; 0,044 r

55 D-ЛДГ из Leuconostoc mesentегоides

DSM 20193; 0,032 г D-ЛДГ из Pediococcus pentosaceus,DSM 20280.

Пример 8. Сравнительный ана- лиз.

1431690

Активность „ед/л

Заданное значение, 50

100

70

250

101

1200

Буферное вещество

L-Алании

Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

10-500

50 †10

0,01-0,25

Таблица 1

Заданное значение, %

ЛДГ через

2ч 10ч

100 103

lOO 97

100 101

)00 . 98

100 100

DSM 2699

DSM 20072

DSM 20174

DSM 20193

DSM 20280

Используя реактивы, которые хранились при комнатной температуре в течение 2 или 10 ч по примеру 1 определяют в пробе активность GPT.

В качестве пробы использовали контрольную сыворотку (Precinorm V589, фирма "Берингер Маннхайм"), активность GPT 32,5 ед/л.

Результаты приведены в табл. 1. ° 10

Пример 9. Определение активности GPT. действуют аналогично примеру 1, причем ЛЦГ применяют в различных количествах. В качестве ЛДГ применяют

ЛДГ Lactobacillus leichnannii DSM

2699, в качестве пробы — контрольную сыворотку (Precinorm 7589, фирма

"Берингер Маннхайм"), активность

GPT 32,5 ед/л. 20

10000 98

20000 99

Добавка большего количества ЛДГ неэкономична из-за стоимости энзима.

Пример 10. Определяют GPTактивность аналогично примеру 6, используя D-ЛДГ, полученную для раз личных микроорганизмов.

Результаты приведены в табл. 2;

Пример 11. Определение GPTактивности в случае различных концент-4 раций ингредиентов реагента.

Проводят опыт. аналогично примеру 1 используя буфер L-аланин, NADH u

0L- кетоглутарат в различных концентрациях. Активность D-ЛДГ составляет, смотря по обстоятельствам, 1200 ед/л.

Результаты приведены в табл. 3.

Пример 12. Определение GOTактивности при различных концентра" циях ингредиентов реагента, 50

Определение ведут аналогично примеру 2,причем буфер,NADH,MDH, сь -кетоглутарат и L-аспартат используют в различных концентрациях. D-ЛДГ-активность составляет, смотря по обстоятельствам, 1 200 ед/л.

Результаты приведены в табл. 4. формула изобретения

Способ определения глутамат-пируват- и глутамат-оксалоацетаттрансаминазы, включающий получение пирувата или оксалоацетата путем трансаминирования oh †êåòîãëóòàðîâ кислоты в присутствии лактатдегидрогеназы и в соответствующем случае малатдегидрогеназы с последующим восстановлением их до лактата. или малата в присутствии никотинамиддинуклеотида восстановленного и измерением в полученной смеси, содержащей буферный раствор, количества образовавшегося никотинамидаденина окисленного, о .т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве лактатдегидрогеназы используют D †лактатдегидрогеназу из Lactobacillus

1eichmannii DSM 2699, Lactobacillus

lactis DSM 20072, Lactobacillus plantarum DSM 20174, Leuconostoc mesentегоides DSM 20193, Pediococcus pentosaceus 20290 с активностью 25020000 ед/л, при этом используют (в конечной концентрации), ммоль/л:

Малатдегидрогеназа 100-20000 ед/л с -Кетоглутарат 1,5-30

L- Аспартат 20-500

Из сердца свиньи 100

1431690 8

Таблица 2

D-ЛДГ

Активность, Заданное ед/л значение

Таблица 3

Показатели

Опыт

Г (А В С

Ингредиенты, ммоль/л

Фосфатный буфер 10 250 500

50 500 1000

001 01 02

ТАланин

NADH

eL-Кетоглутарат 1,5 15 20

Заданное значение, 7 25 100 100

Таблица 4

Опыт

Показатели

А В J С

Ингредиенты, ммоль/л

Трис-буфер

10 250 500

0,01 0,15 0,25

100 U/ë 1000U/3 10000U/3

NADH о -Кетоглутарат

1 5 15 30

20 250 500

L-Аспартат

Заданное значение, 7

20 100 100

ВНИИПИ Заказ 5358/59 Тираж 847 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Из DSM 20072

Из DSM 20174

DSM 20193

DSM 20280

250

20000

250

20000

250

20000

250

20000

68

103

79

101

72

8l