Способ получения ферментного препарата l- лизиндекарбоксилазы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения - увеличение ферментативной активности и стабильности. Для получения ферментного препарата лизиндекарбоксилазы - аналитической композиции - проводят глубинное культивирование бактерий Escherichia coli MRE 600 в питательной среде, содержащей , мас.%: глюкоза 0,35-0,4; пептон 0,09-0,11; лизин кормовой кристаллический 0,78-0,82; натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,22-0,24; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,52- 0,54; натрий хлористый 0,09-0,11. Выращивание проводят в анаэробных условиях без насыщения питательной среды воздухом и ее перемешивания при рН 6,0- 6,2 и температуре 30-32 С до достижения оптической плотности культуральной жидкости, 0,4-0,45 (540 нм, 0,5см). Отцентрифугированную биомассу ацетонируют 4-6-кратным объемом ацетона. Ацетонированные клетки смешивают с безводным однозамещеннымфосфатом натрия,двузамещенным фосфатом натрия,растворимым крахмалом, глюкозой, стеаратом кальция в соотношении, мас.%: 12:45,4:3,2: :30,4:8:1 соответственно, и таблетируют при давлении, обеспечивающем распадаемость таблеток в воде при 40 - 50 С в течение 0,5-1,0 мин. 1 ил. 2 табл. (Л 4 О9 СО СО 00

СОЮЗ СОНЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН дц 4 С 12 М 9/88, 9/96

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4173195/28-13 (22) 04.11.86 (46) 30. 10.88. Бюл. N 40 (71) Научно-производственное объединение "Фермент", Вильнюсский государственный университет им.В.Капсукаса и Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) Г.Б.Шебека, P.Ï.ßíóøÿâè÷þòå, А.-А.Б.Паулюконис, Д.А.Казлаускас, С.-В.И.Берецкене, A.Â.Ðóçãåíå, А.Б.Рагавичюс, Т.П.Тарасова и В.Х.Тихонов (53) 663.15 (088.8) (56) Глемжене И.И. и др. Микробиология и производство. Вильнюс, 1981, с.23-26.

Наумчик Г.Н. и др. Особенность технологии лекарственных форм ферментов микробного происхождения. — Сборник научных трудов: Химия, технология производства и медико-биологическое исследование ферментных препаратов медицинского назначения. М., 1983, с.52-58.

Авторское свидетельство СССР

Р 1307851, кл. С 12 N 9/88, 1985.

„„SU„„1433981 A 1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО

ПРЕПАРАТА L-ЛИЗИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промьппленности. Цель изобретения — увеличение ферментативной активности и стабильности. Для получения ферментного препарата лизиндекарбоксилазы — аналитической композиции — проводят глубинное культивирование бактерий Escherichia coli

MRE 600 в питательной среде, содержащей, мас.Ж: глюкоза 0,35-0,4; пелтон

0,09-0,11; лизин кормовой кристаллический 0,78-0,82; натрий фосфорнокислый двуэамещенный 0,22-0,24; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,52- ф

0,54; натрий хлористый 0,09-0,11. Выращивание проводят в анаэробных условиях без насыщения питательной среды воздухом и ее перемешивания при рН 6,0-

6,2 и температуре 30-32 С до достижения оптической плотности культуральной жидкости, 0,4-0,45 (540 нм, 0,5 см). фее

Отцентрифугированную биомассу ацето- ф нируют 4-6-кратным объемом ацетона. Ацетонированные клетки смешивают с безвод- в© ным однозамещенным фосфатом натрия, двузамещенным фосфатом натрия, растворимым крахмалом, глюкозой, стеаратом кальция в соотношении, мас.7.: 12:45,4:3,2:

:30,4:8:1 соответственно, и таблетируют при давлении, обеспечивающем распадаемость таблеток в воде при 40—

50 С в течение 0,5-1,0 мин. 1 ил.

2 табл.

1433981

Изобретение относится к микробиологической промьппленности, в частности к производству ферментов, и каса- ется получения ферментного препарата лизиндекарбоксилазы — аналитической композиции, используемого в качестве реагента для определения концентрации L-лизина в растворах при работе автоматического L-аминокислотного анализатора.

Цель изобретения — увеличение ферментативной активности и стабильнос5

1,3 раза при применении 250-литровых ферментеров и в 3 раза при укрупненном производстве с применением t500литровых ферментеров. Кроме значительного повьппения лизиндекарбоксилазной активности в последнем случае

40 в препарате отсутствует индуцируемая глутаминовой кислотой, которую содержит пептон, глутаматдекарбоксилазная активность, появляющаяся в аэробных условиях.

Улучшение условий техники безопасности при ацетонировании биомассы достигнуто путем применения меньшего (в 4 раза) количества ацетона (легко возгорающейся жидкости) взамен его

18-20-кратного объема, а также отка-50 за от промывания ацетонированной биомассы ацетоном и эфиром, обладающим сильным наркотическим действием.

При этом лизиндекарбоксилазная активность ацетонированных клеток повьппается в 1,3 раза, а стабильность при хранении — в 1,5 раза. ти.

На чертеже показана зависимость 15 остаточной лизиндекарбоксилаэной активности биомассы, высушенной разными способами, от продолжительности хранения, где кривая 1 — биомасса, обработанная ацетоном и эфиром (по 20 известному способу); кривая 2 — биомасса обработанная ацетоном без эфиФ ра (по предлагаемому способу).

Способ заключается в том, что понижение в 2 раза концентрации пептона и глюкозы в питательной среде, отказ от насьпцения воздухом питательной среды и перемешивания культуральной жидкости во время ферментации, сужение интервала температуры выра- 30 щивания биомассы до 30-32 взамен 30о

34 С и укорочение времени культивирования бактерий до 3-3 5 вместо 4—

5,5 ч позволяет повысить лизиндекарбоксилаэную активность препарата в

Компоненты препарата лиэиндекарбоксилаэы — аналитической композиции— ацетонированная биомасса клеток продуцента лизиндекарбоксилазы, однои двузамещенные фосфаты натрия,растворимый крахмал, глюкоза и стеарат кальция в соотношении, мас.%: 12:45, 1

4:3, 2:30, 4:8:1, позволяют получить при помощи таблеточного пресса таблетки, растворяющиеся в 1 мл анализируемой жидкости при 40-50 С и перемешивании в течение 0,5-1,0 мин с образованием буферного раствора с рН 5,5 и лизиндеркабоксилазной активностью не менее 4 ед/мл, т,е, обладающие свойствами, необходимыми при работе автоматического анализатора лизина при серийных анализах.

Пример. Музейную культуру перассевают на 2%-ный мясо-пептонный агар (МПА) в чашки Петри и инкубируют в термостате при 30 С 24 ч. Оживленную культуру пересевают на косяки МПА в 30 пробирках и инкубируют при 30 С 24 ч. Культуру, выросшую на косяках, далее выращивают в среде объемом 3,750 л, содержащей, мас.%: глюкоза 0 4; пептон 0 1 кормовой лизин кристаллический 0,8; натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,23; калий однозамещенный фосфорнокислый

0,53; натрий хлористый 0,1 рН среды

6,4. При подготовке среды раствор глюкозы стерилизуют при 0,5 атм

30 мин, а смесь растворов остальных компонентов — при 1 атм 20 мин. Кульо туру инкубируют при 30 С 5 ч и используют для приготовления инокулята в сателлите, содержащего -37,5 л питательной среды того же состава.

Инокулят выращивают при 32 С до оптической плотности 0,8 при 540 нм и толщине слоя 0,5 см. Инокулят засевают в ферментер объемом 1500 л, содержащий 710 л питательной среды с рН 6,3. Ферментацию проводят при о

31 С без перемешивания и подачи воздуха со свободным падением рН до 6,0 до образования оптической плотности среды 0,4 при 540 нм и толщине слоя

0,5 см. Суспенэию клеток охлаждают до 10 С и биомассу отцентрифугируют при 17000 об/мин. Получают 900 г сырой биомассы. Измеряют активность биомассы после ее дезинтеграции ультразвуком при следующих условия : рН 5,7, 37 С„ концентрация субстрата

0,05 М, пиридоксальфосфата 0,05 мМ.

1433981

Лиэиндекарбоксилазная активность биомассы составляет 10 ед/мг сухого вещества, удельная активность 32 ед/мг белка, глутаматдекарбоксилазная ак5 тивность не обнаруживается.

Ацетонирование биомассы проводят порциями по 70 г. К навеске биомассы добавляют 10 мл физиологического раствора и в ледяной бане размешива- 10 ют до получения однородной суспензии; в которую при перемешивании приливаО ют 350 мл охлажденного до +4 С ацетона, перемешивают,10 мин, фильтруют на вакуум-фильтре и высушивают на 15 воздухе.

Необходимые комоненты аналитической композиции в количестве 33 r ацетонированных клеток, 124,8 r натрия фосфорнокислого однозамещенного, 20

8,7 г фосфорнокислого двузамещенного, 83,6 r растворимого крахмала, 22 г глюкозы, 2,75 г стеарата кальция перемешивают до образования однородной массы и таблетируют на прессе ПЛТ-1 25 с пресс-инструментом 75 мм. Применяется такое давление прессования, при котором время распадаемости таблетки о в 1 мл воды при 42 С и перемешивании не превышало 1,0 мин. 30

Значение РН образовавшейся суспензии соответствует 5,5 лизиндекарбоксилазная активность — 13 ед/мл.

Пример приведен при одних значениях параметров, так как в гРаницах до-35 пустимых колебаний результат — качество аналитической композиции — не меняется.

Влияние аэрации на лизиндекарбоксилазную активность биомассы и об- 40 разование сопутствующей глутаматдекарбоксилазной активности показано в табл. 1.

При выращивании продуцента в 45

1500-литровых ферментерах (масштабирование около 8 раз) по предлагаемому способу лизиндекарбоксилазная активность сырой биомассы, а также после ее ацетонирования в среднем в 3 раза выше, чем по известному способу.

Кроме того, в биомассе не содержится нежелательная примесь глутаматдекарбоксилазы. Это объясняется тем, что при ферментации в больших объемах, (1500 л) перемешивание и насыщение воздухом питательной среды приводит к появлению сопутствующей глутаматдекарбоксилаэной активности и снижению лизиндекарбоксилазной активности.

Зависимость лизиндекарбоксилазной активности биомассы от количества ацетона показано в табл. 2.

Для ацетонирования биомассы, суспендированной в минимальном количестве физиологического раствора в соотношении 7:1 соответственно, необходимо использовать 4-6-KpaTHbrA объем ацетона.

Последующая обработка ацетонированной, биомассы эфиром ухудшает стабильность лизиндекарбоксилазной активности при хранении (см.чертеж).

Как видно из чертежа, при хранении в течение года остаточная активность биомассы, обработанной ацетоном согласно изобретению, в 1,5 раза выше, чем по известному способу. Поэтому для повышения стабильности лизиндекарбоксилазной активности следует отказаться от досушивания ацетонированной биомассы эфиром.

Использование предлагаемого способа получения ферментного препарата лизиндекарбоксилазы — аналитической композиции — дает следующие преимущества:

При выращивании продуцента лизиндекарбоксилазы в 1500-литровых ферментерах, т.е. при масштабировании процесса ферментации в 8 раз, можно получить в 3 раза более активную биомассу.

Сокращается время, знергозатраты и упрощается подготовка питательной среды для ферментации. Так, стерилизация растворов лизина, пептона, одно- и двузамещенных фосфатов натрия, хлористого натрия производится совместно, что особенно важно при больших объемах растворов. Для получения посевного материала требуется эа. ев культурой 30 пробирок (вместо 60).

Питательная среда не продувается воздухом в течение 35 мин и не перемешивается, что позволяет экономить время и энергию.

Питательная среда содержит в 2 ра" за меньше глюкозы (0,4 вместо 0,8X) и в 2 раза меньше пептона (0,1 вмес то 0,2 ), что позволяет экономить пищевое сырье и удешевить процесс ферментации, а также исключить индуцирование глутаматдекарбоксилазной активности, 1433981

Таблица 1

Объем Колипита- честУсловия аэрации по способу

Активность биомассы, ед/мг тельной во сырой биоГлутаматдекарбоксилаЛизинсреды л декарбоксимассы, г лаза за

Известному+ 900

1070, 3,2 0,54

760 2,8 0 33

650

870 10

800 8

Предла- 900 гаемому++ 650 следы следы

Отказ от насьш ения воздухом питательной среды и перемешивания во вреь1я ферментации при ее масштабироваии в 8 раз позволяет избежать обра5 зования сопутствующей глутаматдекарбоксилазы.

Ацетонирование биомассы проиэвод ится 4-6-кратным (вместо 18-20) объе ом ацетона, являющегося легко возгорающейся жидкостью (ЛВЖ), без применения эфира (ЛВЖ, сильный наркотик), ч о значительно сокращает расход мат риалов и улучшает условия техники б зопасности работающих. 15

3а счет изменения условий ацетонир вания биомассы стабильность лизинд карбоксилазной активности при хра-, н нии возрастает в 1,5 раза, а активн сть — в 1,3 раза. 20

При таблетировании аналитической к мпозиции используются клетки, ацет нированные 4-6 объемами ацетона, ч о позволяет избежать значительной (о 40 ) инактивации ферментативной 25 а тивности, которая обычно происходит прн таблетировании ферментов.

Применение ферментного препарата— аналитической композиции — позволяет автоматизировать процесс выполнения 30 анализов. Препарат предназначен в к честве реактивов для серийных аназов, выполняемых при помощи автоматического анализатора лизина, в противоположность препарату лизиндекфрбоксилазы; полученному по извести< му способу и используемому для одиночных анализов, выполняемых вручную.

С став и соотношение компонентов аналитической композиции позволяет обес- 40 почить необходимый рН (5,5) и лизинд4карбоксилазную активность (не менее 4 ед/мл) в анализируемых пробах культуральной жидкости. Это позволяеч исключить взвешивание на аналитических весах ферментного препарата при кажцом единичном анализе, приготовление буферов, контроль в каждой анализируемой пробе значения рН.

Формула изобретения

Способ получения ферментного препа рата 1-лизиндекарбоксилазы путем гпубинного культивирования продуцента Escherichia .coli NRE 600 в питатепьной среде, содержащей глюкЬзу, натрий фосфорнокислый двузамещенный в количестве 0,22-0,24 мас,, калий фосфорнокнслый однозамещенный в количестве 0,52-0,54 мас., натрий хлористый в количестве 0,09-0,11 мас., пептон, лизин кормовой кристаллический в количестве 0,78-0,82 мас., дистиллированную воду прн рН 6,0-6,2 с последующим отделением клеток центрифугированием и ацетонированием биомассы, отличающийся тем, что, с целью увеличения ферментативной активности и стабильности, процесс культивирования проводят в анаэробных условиях до достижения оптической плотности культуральной жидкости 0,4-0,45, причем количества глюкозы и пептона устанавливают соответственно равными 0,35-0,40 и

0,09-0,11 мас.%, ацетонирование биомассы ведут 4-6-кратным объемом ацетона, полученные ацетонированные клетки смешивают с безводным однозамещенным фосфатом натрия, двузамещенным фосфатом натрия, растворимым крахмалом, глюкозой, стеаратом кальция в соотношении, мас.%: 12:45, 4:3, 2:30, 4:8: 1 соответственно, и таблетируют при давлении, обеспечивающем распадаемость таблеток в воде при 40-50 С в течение 0,5-1,0 мин.

Насыщение питательнои среды воздухом 10 и /ч в течение

35 мин и перемешивание 200 об/

/мин во время ферментации.

Ф 4.

Без насыщения воздухом и перемешивания

1433Э81

Т а б л и ц а 2

Активность высушенной биомассы, ед/мг

Соотношение объема ацетона к объему сырой биомассы

3,6

20

3,6

3,7

4,1

4,2

4,1

100

Составитель И. Привалова

Редактор М.Петрова Техред М.Ходанич

Корректор О.Кравцова

Заказ 5517/28 . Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

- 60

Сэ Я р ч

1 2 3 4 $ g 7 8 9 16 11 f2

Ерема хранения, пес.