Способ получения модифицирующих метилаз sso @ и sso @

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения сайт-специфических метилаз SsoII и Ssol. Изобретение позволяет получать из штамма Shigella sonnei 47 одновременно две модифицирующие, метилазы SsoII и Ssol, обладающий высокой стабильностью (более 12 мес). Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса . Способ предусматривает культивирование клеток Shigella sonnei 47, их разрушение ультразвуком, центрифугирование при 105000 g, освобождение от нуклеиновых кислот с помощью сульфата стрептомицина, высаливание белков сульфатом аммония (80% от насыщения ) и проведение гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе с использованием комбинированного линейного градиента понижакнцейся концентрации сульфата аммония от 1,0 до 0,0 М и повышающейся концентрации тритона Х-100 от 0,30 до 0,60% и отбором фракций, соответствюущих для SsoII и для Ssol после хроматографии на фенил-сефарозе при концентрации тритона Х-100 соответственно 0,43 и 0,52%. 2 ил., 2 табл. iS (Л 4i 00 00 СО 4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУбЛИК (19) (И) А1 (51) 4 С 12 N 9/88//(С 12 И 9/88, С 12 R 1:01) Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4212546/31-13 (22) 19.03.8? (46) 15.11,88. Бюл. Ф 42 (71) Научно-исследовательский институт медицинской энэимологии АМН

СССР и Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (..72) С.С.Дебов, И.И.Никольская-Санович, Н.Г.Лопатина, И.M.Ãðóáåð и В.М.Поляченко (53) 577. 15{088.8) (56) Лопатина Н.Г. и др. Сайт-специфичность ДНК-метилаз из клеток Shigella sonnei 47. — Биохимия, 1985, т. 50, У 10, с. 1694-1701.

Карташева И.M., Никольская И.И., Дебов С.С ° Выделение ферментов модификационного метилирования и рестрикции из Shigella sonnei 47. - Молекулярная генетика, микробиология и ви, русология, М., 1985, У 4, с. 31-35. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРУКЩИХ

МЕТИЛАЗ SSOII И SSOI (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения сайт-специфических метилаз SsoII u

SsoI. Изобретение позволяет получать из штамма Shigella sonnei 47 одновременно две модифицирующие. метилазы

SsoII и SsoI, обладающий высокой стабильностью (более 12 мес). Цель изобретения — упрощение и ускорение процесса, Способ предусматривает культивирование клеток Shigella sonnei 47, их разрушение ультразвуком, центрифугирование при 105000 g, освобождение от нуклеиновых кислот с помощью сульфата стрептомицина, высаливание белков сульфатом аммония (80X от насыщения) и проведение гидрофобной хроматографии иа фенил-сефарозе с использованием комбинированного линейного градиента понижающейся концентрации сульфата аммония от 1,0 до 0,0 М и повышающейся концентрации тритона

Х-100 от 0,30 до 0,60Х и отбором фракций, соответствюущих для SsoII и для SsoI после хроматографии на фенил-сефарозе при концентрации тритона Х"100 соответственно 0,43 и

0,527.. 2 ил., 2 табл.

1437394

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии и касается способа получения сайт-специфических метилаз.

Цель изобретения — упрощение и

5 ускорение процесса.

Способ предусматривает замену глицерина на тритон Х-100 повышающейся концентрации при гидрофобной хромато- 10 графии на фенил-сефароэе, отбор ферментов из соответствующих пиков активности и исключение стадии изозлектрофокусирования.

Пример 1. Клетки Shigella 15

sonnei 47 культивируют на бульоне

Хоттингера с добавлением 20% глюкозы до достижения 10 млрд бактериальных тел в мл при 37 С..Клетки осаждают центрифугированием. Затем клетки сус- 20 пендируют в рабочем буфере, рН 7,4, содержащем 20 мМ калий фосфата, 7 мИ (-меркаптоэтанола и 1 мМ ЭДТА, и раз.рушают на ультразвуковом деэинтеграторе. Обломки клеток удаляют центри- 25 фугированием. в течение 1 ч при

105000 я. Осадок отбрасывают. Надосадочная жидкость представляет собой грубый экстракт. Освобождение от нуклеиновых кислот проводят с помощью 30 сульфата стрептомицина. Осаждение белков проводят сульфатом аммония

80% от насыщения. Осадок растворяют в рабочем буфере, содержащем 1 И сульфата аммония и 0,3% тритона Х-100 и наносят в количестве 10 мг белка иа колонку размером 17 0,7 см с фенил-сефарозой, уравновешенную тем же буфером. Колонку промывают тремя объемами буфера и ферменты элюируют двойным линейным градиентом понижающейся концентрации сульфата аммония от 1 до 0„3 N и повышающейся концентрации тритона Х-100 от 0,30 до 0,45%.

Объем градиента 48 мл. Объем собираемой фракции 1 мл.

При этом пик активности метилазы

SsoI отсутствует, что показано на фиг. 1 и табл. 1.

Пример 2. Культивирование

50 клеток, их разрушение, получение грубого экстракта, освобождение от нуклеиновых кислот и высаливание белков сульфатом аммония ведут как в примере 1, Белок, нанесенный на колонку

55 с фенил-сефарозой, элюируют линейным градиентом концентрации сульфата аммония от 1 до 0 М и тритона Х-100 от 0,30 до 0,60%. Объем градиента

48 мл, объем однои фракции 1 мл. В грациенте обнаруживается два пика метилирующей активности SsoII u Ssol (см. Фиг. 2 и табл. 1).

Для стандартной процедуры выделения фермента был выбран пример 2.

Пик активности метилазы Ssoll обнаруживается во фракциях градиента 1622 и элюируется с колонки 0,43% тритоном Х-100, а метилазы SsoI — во фракциях градиента 25-37 и элюируется 0,52% тритоном X-100. Предлагаемый способ позволяет эа 2 дня получить ферменты с удельной активностью

7000 ед/мг белка. Ферментные препарао ты хранятся при -10 С в течение 12мес

;(срок наблюдения) без потери активности (см. табл. 2). При получении препаратов ферментов по прототипу метилазная активность сохранялась в течение 1--2 сут, активность составляла

3О00-4000 ед/мг белка °

За единицу активности принимащт количество фермента, необходимое для переноса. Ipmol метильной группы Sаденозилметионина на ДНК в течение

1 мин при 37 С.

Активность метилаз определяется с помощью радиоизотопного метода.

Инкубационная смесь объемом 50 мкл содержит 8-10 мкг белка, 5 мкг акцепторной ДНК и 0,5 мкКи H-$АИ. Пробы о инкубируют 1 ч при 37 С, наносят на фильтры GF/Ñ, осаждают 20%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ), отмывают 5%-ного ТХУ и 70%-ным этанолом, высушивают H помещают в толуоловый сцинтиллятор для подсчета радиоактивности.

1 ,о

Для идентификации модифицирующих свойств ферментов реакцию метилирования проводят в инкубационной смеси объемом 100 мкл, содержащей 20 мкг

ДНК фага A, 35-40 мкг белка, 2 икКи

H-БАМ, Пробы инкубируют 24 ч при

37 С.

Реакцию рестрикции проводят в инкубационной смеси объемом 50 мкл следующего состава: 0,1 И трис-НС1 буфер, рН 7,4; 10 мИ МдС1, 1 мИ Р -меркаптоэтанола; 5-7 ед. активности рестриктазы; 1 мкг ДНК фага Я (используется метилированная ДНК). Ино кубацию ведут при 37 С 1 ч. Реакцию останавливают добавлением 5 мкл 50%.— ного глицерина с 100 мМ ЭДТА и 0,5% бромфенолового синего. Рестриктаэн ю ра(п;но:.1 (нрс (гу -:.:. еотидов

ЧЕНИЮ ИЗ ПРОЦЕССа ОЧИСТКИ CÒÇÄÈÈ

Таблица 1

Условия получения препаратов ферментов БЗОТТ и SsoI

Пример Условия градиентного элюированпя Полученный результат

Концентрация сульфата аммо.. (ия

1-0,3 М

11етилаэа ЯЗОТТ элюируется с 28 по 34 фр. — 0,47 тритоном Х-100

Пик активности метилазы Язо? отсутствует

Концентрация тритона Х-100

0>30-0,457

11етилаза Ssoll элюируется с 16 по 22 фр. — 0,43% тритоном X-100

Концентрация сульфата аммония

1-0 М

Концентрация тритона Х-100

0,30-0,607.

11етилаэа SsoI элюируется с

25 по 37 фр. — 0,52% тритоном Х-100

143

I I O O I (b IlJ Э Л Е К Трофореза в 0,87.-ном агарозном геле.

1"ель окращивают раствором этидий бромида в концентрации 3 мкг/мп в течение 20 MHII и фотографируют в ультрафиолетовом свете при 254 нм с красным светофит(ьтром.

Препараты Ферментов, попученные предложенным методом, не содержат экзо- и эндонуклеаз, на что указывает полное сохранение ДПК фага 7 при длительной инкубации (24 ч) избыто 1ных количе тв ферм".íòîâ (10-20 ед,) в условиях, способствующих действи(о

n+ нуклеаз (в присутствии ионов Ир (+) .

Это позволяет использовать метилазы

Я oI I 8ЗОТТ ", экс(Ор(((ентах,О мо-л еку, 1яр((o" б((o (О(1(чее ко"*(у к очГ (py((po нацию ре7 ;01!6(1! а((" l ill Д!(К 3 и ii.(1 гo °.

Сл дует О ((е- ((ть у«((((а(((1(ос(в 1(етплазы 8зОТ:(., Которую эа счет -.ыОО ((-дсннос III сайта узll:1(1ания (К1ж((О 1; пользовать н(- то.."(ьео 1гля за(л(ть(11НК

От соответс i"Ilиэ((:е "О ти((а IJE oò1>(гкацгп(I1O И ОТ (ICJ(OI O (>Я,"1 РС Т и1 Тс(э СОЛЯ. (Д(а(С((И-;„СКОЛ ((i "; .: C Ql! (а(.:1(Уэ . ;- . В.=(в(. 1 н ;(есущ(1 (. 11(,-,, Ожде111(ОС ", li 11О цен гL 1редсожен з:; методе сокра iioно число стадий и время в((деле((и((ферме((то(з SsoХТ и 8вОI благодаря исклю7394

4 изоэлектрофокусирования. Способ может быть использован для получения метилаз 8зоТТ и SsoI необходимых для экспериментов и практических ра5 бот по генной инженерии.

Формула и э обретения

Способ получения модифицирующих метилаз SsoII и SsoI, предусматривающий культивирование клеток бактерий Shige11а sonnei ГИСК Р 172, раз-, рушение их ультразвуком, центрифугирование, освобождение от нуклеиновых кислот сульфатом аммония и гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе .::Омб 1.(((рог,(в.(b(:I линеш(ым градиентом

::Ол(г(аю(((ейся концентрации сульфата

1: ((О(((!11 От 11 до О М и повышающей с.я "OI .öoí".р.(UI(eé элюента с элюцией

SsoII концентрацией сульфата аммония

0,58 11, а Ssol — концентрацией сульфата аммония 0,37 11, о т л и ч а ю25 щ « и с я тем, что, с целью упрощеш.1(и ускорения процесса, гидрофобную кром(1(ог11аф((ю I;,à фенил-сефарозе велуг с ((спал(-зованием в качестве элюснта -Овы(((ающе((ся концентрац((и тритона:.-100 от 30 до 60 мас.%, при это;(8зоТI э-(ю((руюг концентрацией тритона Х-100 — 0,43 мас.%, à SsoI— ко(центрацпсй тритона Х-100

0,52 мас.%.

1437394

Продолжение табл.1

Концентрация тритона Х-100

0,30-0,65Х

Т а б л и ц а 2

Стабильность ферментных препаратов, полученных хроматографией на фенил-сефарозе, при хранении при -10 С

Срок хранения

Sso I

Предлагаемый способ

0 (момент получения ферментов)*

100

100

3 мес.

100

100

100

100

100

100

100

100

Известный способ

0 (момент получения ферментов)

100

100

48

24 ч

Активность в момент получения ферментов принята sa 100X,,6 мес

9 мес

12 мес

Концентрация сульфата аммония

1-0 М

Иетилаза SsoII элюируется с 16 по 22 фр. — 0,43Х тритоном Х-100

Иетилаза SsoI элюируется с

25 по 37 фр. — 0,52Х тритоном Х-100

1437394

2000 ив гор.

При,мер „ ? п/ми

4Ю Крр

Фиг 2

Редактор Н.Киштулинец

Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 5855/25

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4

/77ри 1 иют/ж

АЛО

Составитель И.Привалова

Техред M.Õoäàíè÷ Корректор М.Максимишинец