Способ выделения 6-0-галлоил-1,3-0-гексагидроксидифеноил- @ -д-глюкозы

Авторы патента:

ФАДЕЕВА ИЗАБЕЛЛА ИВАНОВНА

ШЕЙЧЕНКО ОЛЬГА ПЕТРОВНА

ТОЛКАЧЕВ ОЛЕГ НИКИФОРОВИЧ

ШЕЙЧЕНКО ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ

СЕМЕНОВА ТАТЬЯНА СЕРГЕЕВНА

ШИПУЛИНА ЛЮДМИЛА ДМИТРИЕВНА

ВИЧКАНОВА СЕРАФИМА АЛЕКСАНДРОВНА

СИМОНОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА

C07H13/02 - карбоновыми кислотами

A61P31/22 - против вирусов герпеса

A61P31/16 - против гриппа или риновирусов

A61K31/7024 - сложные эфиры сахаридов

Изобретение касается производных Сахаров, в частности способа выделения 6-0-галлоил-1,3-0-гексагидроксвдифеноил-,-1 -глюкозы (гипорамнина)} обладающей противовирусной активностью , и может быть использовано в фармацевтике. Цель - создание нового способа вьщеления нового природного соединения. Для получения целевого соединения листья облепихи крушиновидной экстрагируют 40-60%- ным водным этанолом и экстракт упаривают . Остаток обрабатывают и СНС1д, упаривают водную фазу досуха и хроматографируют -на тойоперле HW-40 с последовательным использованием в качестве элюента смеси этанола с CHClj, этанола, ацетона, 50%-ного водного ацетона. Последнюю фракцию, содержащую таннины, вьщеляют, упаривают ее досуха и остаток растворяют в воде, примеси осаждают этанолом и фильтруют. Маточник упаривают досуха, остаток растворяют в воде, экстрагируют этилацетатом, водную фазу упаривают и остаток хроматографируют на сефадексе LH-20 с последовательным использованием в качестве элюента 96, 90 и 30%-ного этанола. Целевой продукт получают упариванием последней фракции. Новое соединение в 20 раз активней эугениина в отношении вируса герпеса, кроме того, оно обладает активностью в отношении вируса rpimna, что отсутствует у эугениина. 3 табл. ю (Л с 00 fO

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) (51) 4 С 07 H 13/02//А 61 К 31/70

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A BTGPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 ) 4239928/23-04 (22) 03. 04.87 (46) 23.11.88. Бюл. Р 43 (71) Всесоюзный научно-исследовательский.институт лекарственных растений (72) И.И. Фадеева, О.П. Шейченко, О.Н. Толкачев, В.И. Шейченко, Т.С. Семенова, Л.Д. Шипулина, С.А, Вичканова и И.Ю. Симонова (53) 547.455.623.07(088.8) (56) Takechi М., Tanaka Y. Purification and characterization of antiviral substance from the bud of Syzygium aromatica. â€” Planta medica.1981, vol. 42, 9 1, р. 69-74. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ 6-0-ГАЛЛОИЛ-1, 3-0-ГЕКСАГИДРОКСИДИФЕНОИЛ-P-D-ГЛЮКОЗЫ (57) Изобретение касается производных сахаров, в частности способа вы. деления 6-0-галлоил-1,3-0-гексагидро- ксидифеноил- -D-глюкозы (гипорамнина) обладающей противовирусной активностью, и может быть использовано в фармацевтике. Цель вЂ” создание нового способа выделения нового природного соединения. Для получения целевого соединения листья облепихи крушиновидной экстрагируют 40-60Хным водным этанолом и экстракт упа ривают. Остаток обрабатывают Hz0 и

СНС1ь упаривают водную фазу досуха и хроматографируют на тойоперле

HW-40 с последовательным использованием в качестве элюента смеси этанола с СНС1>, этанола, ацетона, 50Х-ного водного ацетона. Последнюю фракцию, содержащую таннины, выделяют, упаривают ее досуха и остаток растворяют в воде, примеси осаждают этанолом и фильтруют. Маточник упаривают досуха, остаток растворяют в воде, экстрагируют этилацетатом, водную фазу упаривают и остаток хроматографируют на сефадексе ЬН-20 с последовательным использованием в качестве элюента

96, 90 и 307-ного этанола. Целевой продукт получают упариванием последней фракции. Новое соединение в

20 раз активней,эугениина вотношении вируса герпеса, кроме того, оно обладает активностью в отношении вируса гриппа, что отсутствует у эугениина, 3 табл.

1439! 07

О о о

Изобретение относится к способу выделения иэ природного источнйка 6-0-галлоил-1,3-0-гексагид20 обладающего противовирусным действием, и может быть использовано в фармацевтике.

Цель изобретения вЂ” разработка нового .способа выделения нового при- 25 родного соединения группы гидролизуемых таннинов.

Цель достигается выделением гипорамнина из измельченных листьев облепихи крушиновидной (Hipyophae rhamnoides Б. ),семейства лоховых (l:laedgmaceae) совокупностью операций экстракции, осаждения и хроматографии.

Пример l. 10 г измельченных листьев облепихи крушиновидной заливают 100 мл 60%-ного этилового спир35 та, через 1 ч экстракт сливают. Таким образом проводят еще 2 экстракции. Экстракты объединяют1 этиловый спирт отгоняют, к остатку добав- 4 ляют 20 мл воды и 5 раз обрабатывают хлороформом в соотношении 10:2. Водный остаток упаривают досуха и хроматографируют на колонке с тойоперлом IN-40 в соотношении 1 г:7 см (диаметр 2,0 см, высота 8,7 cM).Элюируют смесью этанола с хлороформом

1:2 (400 мл) и 1:l (450 мл). Полученные 850 мл элюата, содержащего флавоноиды, отбрасывают, затем колонку промывают еще 100 мл этанола (минорные таннины) и 400 мл ацетона (минорные таннины). Завершают элюирование колонки 50%-ным водным ацетоном. Элюирование ведут под давлением l,l1,2 атм. Первые 50 мл элюата отбрасывают, последующие 130 мл 507-ного водного ацетона содержат таннины,, в т.ч. гипорамнин, роксидифеноил-, -D-глюкозы (гипорамнин) Упаренную водно-ацетоновую фракцию (0,86 г) растворяют в 4 мл воды, приливают 30 мл 96%-ного этилового спирта, выпавший осадок отфильтровывают, промывают 5 мл 967-ного этилового спирта, отбрасывают водноэтанольный маточный раствор, упаривают, растворяют в 4 мл воды, отрабатывают этилацетатом (5 мл 4), водную фазу упаривают (0,3683 r) и остаток хроматографируют одновременно на 7 колонках с сефадексом LH-20 (по 0,052 r смеси таннинов на каждой колонке, диаметр колонки 1,4 см, высота 5,5 см). Каждую колонку промывают 50 мл 96%-ного этанола и 25 мл

907-ного водного этанола, завершают элюирование 50 мл 307-ного водного этанола. Последнюю фракцию упаривают, получают 0,2576 r гипорамнина (2,577 на воздушно-сухое сырье), светлокоричневый порошок,(<) + 41 (с 0,40, метанол).

ИК-спектр (вазелиновое масло) 1, см 1600, 1720 (С = О) 3100-3600 (он).

Под действием разбавленной мивЂ” неральной кислоты гипорамнин гидролизуется с образованием глюкозы, галловой и эллаговой кислот (l:1:)}, Место присоединения галлоильной (7,12 м.д., С, 2Н) и гексагидрокси-. дифеноильной (6,50 и 6,78 м.д., синглеты, 1Н) групп, а также конформация углеводородного цикла (2 В) определяются данными Н-ЯМР-спектра.

В таблице приведены данные химсдвигов Р; и констант взаимодейст143910

БИЯ, .;, „?? РОТО?? ОВ В ГЛЮК ОПИП?!5? О ЭвЂ” ! + ? ном фрагменте гипорамнина.

Чистоту полученного соединения устанавливают методом ТСХ на пластичках с целлюлозой "Г111гаК" в системе бутанол; уксусная кислота; вода

20:5:9, проявляют спиртовым раствором FeC1, Пример 2. Экстракцию !Î г измельченных листьев облепихи проводят аналогична с тем отличием, что высушенную водно-аиетоновую фракцию (0,86 г) хроматографиру?от на колонке с тойоперлом HN-40 в соат3 ношении Iг:8 см, далее процесс осуществля?от по при ?еру 1. Выход и=левого продукта 0,2570 г (2-,57:- от массы воздушно-сухого-сырья!.

Пример 3. Экстракцию 10 г измельченных листьев облепихи проводят аналогично примеру 1 с тp>i отличием, что Бысушсп водную фракцию хроматографируют на колонке с тойоперлом )!И-40 i7 coo??cj effпи 1 г:

: 6 CM . Далее про?1ес с осу?цествл5ьот

3 по примеру I. Выход целевого -родукта 0,2560 г (2,56% от массы ьоздушно-сухого сырья).

Пример 4. Процесс осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что высушенную водно-ацетоновую фракцию хроматографиру?от на колонке с сефадексом LH-20 в соотношении 0,01 г:)см . Выход целевого продукта 0,2560,г (2,56% от массы, воздушно-сухого сырья), П р и,м е р 5. Процесс осуществляют аналогично 5?р5п?еру 1 с тем отличием, что водна-ацетоновую фраквЂ” цию хроматографируют на колонке с сефадексом в соотношении 0,01г:

:2 см . Выход целевого продукта

0,2560 r (2,56% от массы воздушносухого сырья).

Пример 6. Процесс осуществляют аналоги но примеру 1 с тем отличием, что экстракцию ведут 50%ным этиловым спиртом. Выход целевого продукта 0,2570 г (2,57% от массы воздушно-сухого сырья).

Пример 7. Процесс осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что экстракцию ведут т 40%этиловым спиртом. Выход целевого продукта 0,2561 г (2,56% от массы возду???но-сухого сырья).

Пример 8. Процесс асуществля?от аналогично примеру 1, -Ffo экс т-ра к Циьо в едут I ОУ= вЂ” нь?м э тило вым с?i ifp"том. Выход целевого продукта О, 104 ? . (1,044% от массы воздушно-сухого сырья), П р : e p 10. Процесс осущес-Бльпот аналогично примеру 1, по экст10 рак ппо ведут 80%-ным этиловы.? спирто . Выход целевого продукта О.! 70 и,. ! с:

1, 5 1 . c f F j !1 c c f B o 7 j у ш н о - c w x o I o I

PЬ5!

1": р и м е р !1. Процесс осущест15 Бляют аналогично примеру 1, но экстракпию ведут этиловым спиртом. Выход слепо? о iipo,.укт» 0„0 90 г (0, 9 : т !

:". -ссь? Боздуш . - ухого сьгрья:: . с:, e fj o;j,):?;;e про i i?go! рус но,,.! к - 0 T if«пост?! ??Па)оа н??на Б атно?псп?! i? руса f epifecà. Пзyi? c7ffe 7»pyci!??Бf?5èру?ошего действия Ипора;,?НИ5?а и

???е?? 1" в??рус а Р 1 1 е са 1 типа ?о1 ам ?

1i °

??роводят НР\!Б??чнотр?! jci jj i ро?-. ?I!!cй к с ?1i. i ., ре клеток f) ?Г pi

Г топ курило?-а -:-мб рпона, ФЭ1;) .

)i?Р, С СО 7 P P::.iа?:?5 «XИДКОС Ь Ь .,". !-! .-л;- с >дер?;ëe;;i;!:сь? вируса ), 10, : !!. 0 Т11, 1, м f наносят на мо??асл 1 .

?оо

30 ifульт г?1?.? ?cfie1 о?; к риных ?)1??броо,;f:j,, o: дл» контакта Впруcë с клеткой ° "с

peç 1 ч Qäÿëf!K!ò остатки Вируса ?! Бо флаконы вносят среду без сыворотки

, контроль р;?зм??о!гения вируса) . В о??!«1 ные флаконы вносят среду без сыворо ки с растворимой Б ней максимально псреносимой концентрацией гипорамни"на, не обладающей цитотоксическим действием на клетки. Учет опыт". fjpo-40 водят по наступлению цитопатогенногс действия как в опытных, так и в контрольных флаконах после инкубпровавЂ” о ния в термостате при 37 С Б течен??е

3 вЂ” 5 дн.

45 Данные изучения Бирусингибиру?ощсй активности гипорамнина в отношении вируса гернеса приведены в табл. 2-.

В результате проведенных исследо ваний установлено (табл. 2), что

50 гипорамнин в концентрации 0,5ыкг/мг? ингибируют 10 ТБД вируса герпеса

?оо о it

° типа штамм . Л, Псследованпе противовируснай ак-тивности гипорамнина в отношении вируса гриппа, Вирусне??тралпзу?ог?ое деиствие гю?орамнина изучак т в отно-. шении вируса гриппа штамм А Лнглия в контактных опыггах и -гОга с и! ?п?кацией на куриных эмбрионах.

"Ч Т Г ) ГT Т

5,43 5,30 4,08 4,82

2,3 3,4

9,0 2,0

4,5 5,6 "6,6

J 4,8

9,7 2,9 13,3 О

5 1439

Гипорамнин растворяют в буферном растворе с рН 7,2-7,4 в концентрациях 1, 10, 1 00 и 1000 мкг/мл и смешивают с различными количествами эмб5 риональных инфекционных доз 1, 10, 1 00 и 1000 ЭИД 1О вируса гриппа.

Смеси препарата с вирусом выдержиD вают в течение 1 ч при 14 С, после чего вводят по 0,2 мл в аллантоис- 10 ную полость 9-10-.дневных интактных куриных эмбрионов. Через,48 ч куриные эмбрионы вскрывают и в аллантоисной жидкости определяют наличие вируса методом реакции гемагглю- 15 тинации. Активность препарата выражают количеством нейтрализованных эмбриональных инфекционных доз вируса.

Данные изучения вируснейтрализую- 20 щей активности гипорамнина в. отношении вируса гриппа штамм А Англия приведены в табл. 3.

В результате проведенных исследований установлено (табл. 3), что 25 гипорамнин обладает высокой активностью в отношении вируса гриппа штамм А Англия: концентрации 100 и

1000 мкг/мл гипорамнин ингибируют

1000 ЭИД р (эмбриональные инфек- 30

) оо ционные дозы) вируса гриппа и концентрации 10 мкг/мл гипорамнин ингибируют 10 ЭИД,, вируса гриппа.

Сравнение полученных данных по противовирусной активности гипорам- Зб нина и известных данных по эугениину (близкой по структуре эллаготаннин из Syzygium aromatica) позво-! ляет установить, что гипорамнин (ингибирующая концентрация 0,5мкг/мл ) 40

g 5,65 4,70 5,40

107 6 в 20 раз более активен, чем эугениин (ингибирующая концентрация 10мкг/мл) в отношении вируса герпеса. Кроме того, для гипорамнина установлена также вируснейтрялизующая активность в отношении вируса гриппа, осутствующая у эугениина.

Таким образом, предлагаемое вещество, выделенное из природного сырья, вЂ” гипорамнин, обладает высокой противовирусной активностью.

Формула изобретения

Способ выделения 6-0-галлоил-1,3-О-гексагидроксидифеноил-P-D-глюкозы, отличающийся тем, что, листья облепихи крушиновицной (Hippophae rhamnoides .) экстрагируют 40-60Х-ным. водным этиловым спиртом, остаток после упаривания обрабатывают водой и хлороформом, водпую фазу упаривают досуха, хроматографируют на тойоперле НУ-40 с. использованием в качестве элюепта последовательно смеси этилового спирта и хлороформа, этанола, ацетона, 50Z-ного водного ацетона, выделяя последнюю фракцию, содержащую таннины, упаривают досуха, растворяют в воде, примеси осажцают этанолом, маточник после фильтрации упаривают досуха,растворяют в воде, экстрагируют этилацетатом, остаток после упвривания водной фазы хроматографируют на сефадексе LH-20 с использованием.в качестве элюента этилового спирта последовательно 967, 907о, 307о, получая целевой продукт упариванием последней фракции.

1439107

Т а б л и ц а 2

Активная концентрация, мкг/мл

Вещество

Активность

Гипорамнин

0,5

Полностью ингибирует репродукцию вируса в дозе

10 ТЦЦ,, в первичнотрипсинизированной культуре клеток ФЭК

10,0

Эугениин

Тормозит репродукцию ви-„ руса в перевиваемых эпи" телиоидньгх клетках