Способ получения иммобилизованного протосубтилина
Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности, а именно к биологически активным соединениям , конкретно к иммобилизованным протеазам, которые могут быть использованы в производстве биопрепаратов , добавок к синтетическим моющим средствам, парфюмерии, ветеринарии , медицине. Цель изобретения - повышение качества целевого продукта. Способ заключается в иммобилизации протосубтилина на органическом носителе . В качестве носителя используют полиэтиленоксид с мол.м. 600-2000 килодальтон при соотношении носителя и фермента 1:7,5-1:8,5. Смесь носителя и фермента в водном растворе подвергают обработке у-лучами дозой 2,3- 2,7 мрад. Полученный npenapat обладает повьппенной активностью и термостабильностью и, кроме того, активен в более широком диапазоне рН. 5S (Л 4 4 rs: ел 4 00
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ:
РЕСПУБЛИН (5Н 4 С 12 N 11/00, 9/56
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО.ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4035527/31-13 (22) 23.12.85 (46) 07.12.88. Бюл. N - 45 (71) Институт цитологии и генетики
СО АН СССР и Бердский,. химический завод (72) Р.И.Салганик, A.M.Гончар, А.В,Троицкий, Л.А.Богданова, С.И.Смирных, Ф.Н.Чегодаев, Т.Ф.Ломовская, А.И.Пахтуев и Л.В.Плаксюк (53) 5?7.15(088.8) ,(56) Maeda Н. et. al. Biotechnology
Bioeng. 1973, 15, р. 607-609.
Земцова Л.В. и др. Иммобилизация протосубтилина и исследование свойств иммобилизованного фермента. — В кн.:
Иммобилизованные протеолитические ферменты в лечении гнойно- некротических процессов. — Новосибирск: ИЦ и ГСО АН СССР, 1981 с. 9-23.
„,SU„„1442548 А 1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЖ1ОБИЛИЗОВАННОГО ПРОТОСУБТЙЛИНА (57) Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности, а именно к биологически активным соединениям, конкретно к иммобилизованным протеазам, которые могут быть использованы в производстве биопрепаратов, добавок к синтетическим моющим средствам, парфюмерии, ветеринарии, медицине. Цель изобретения — повьппение качества целевого продукта, Способ заключается в иммобилизации протосубтилина на органическом носите. ле. В качестве носителя используют полиэтиленоксид с мол.м. 600-2000 ки- М лодальтон при соотношении носителя и фермента 1:7,5-1:8,5. Смесь носите- Ф Ф ля и фермента в водном растворе под- ( вергают обработке -лучами дозой 2,32,7 мрад. Полученный препарат обла- ф дает повьппенной активностью и термостабильностью и, кроме того, активен в более широком диапазоне рН. 4ь
1442548
Изобретение относится к химико-фармацевтической промьппленности, а именно к биологически активным химическим соединениям, конкретно к иммобилизованным протеазам, которые могут быть использованы в производстве биопрепаратов, добавок к синтетическим моющим средствам, парфюмерии, ветеринарии, медицине и т.д. 10
Цель изобретения — повышение качества иммобилизованного протосубтилина.
Способ заключается в иммобилизации протосубтилина на полиэтиленоксиде с 15 мол. массой 600-2000 к0 при соотношении носителя и фермента 1:7,5 — 1:8,5.
Смесь носителя и фермента в водном растворе подвергают обработке -лучами в дозе 2,3-2,7 мрад. 20
Связанные между протосубтилином и полимерным носителем осуществляется радиохимическим воздействием в растворе. Это позволяет получать конечный продукт в виде водного раст- 25 вора иммобилизованных протеаз, обладающих высокой протеолитической активностью (по казенну) до 100 ПЕ/мл, высокой термостабильностью в присутствии субстрата, способных гидролизовать субстрат в широком дипазоне рН, проявляя при этом высокую активность. Неспецифическое комплексообразование между полиэтиленоксидом ,и протосубтилином в водном растворе способствует иммобилизации в результате сближения реагирующих молекул в момент радиохимического взаимодействия.
Пример 1. 5 г протосубтилина растворяют в 95 мл 0,05 М боратного буфера рН 8,4 при 2-4 С в течение
30 мин. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием при 7100 g в течение 30 мин. К 8 мл супернатанта 5 добавляют 42,S мл 10,0 -ного водного раствора полиэтиленоксида 1500. Соот" ношение,aecoaoe) протосубтилин:полиэтиленоксид i:8,S. Смесь фермента с носителем облучают тормозным (:-из50 лучением в дозе 2,5 мрад.
При этом получается продукт со следующими свойствами.
Протеолитическая активность
93,0 ПЕ/мл, Термостабильность.
С: 37 45 50 60 70 80
Активность, .: 34 46 71 100 49 8
Зависимость активности от рН субстрата (1 . сывороточного альбумина):
«рН 6ю0 8,2 8;6 11ю0
Активность, %: 47 66 68 100
Продукт растворим. Выход 98,021,0%.
Пример 2 ° Готовят раствор протосубтилина по методике, описанной в примере 1. К 8 мл раствора протосубтилина (супернатанта) добавляют
37,5 мл 10,0 -ного раствора полиэтиленоксида 1500. Массовое соотношение протосубтилин:полиэтиленоксид 1:7,5.
Смесь облучают тормозным -излучением в дозе 2,5 мрад.
Свойства получаемого продукта.
Протолитическая активность
105,0 ПЕ/мл.
Термостабильность.
t, C::37 45 50 60 70 80
Активность, .: 34 46 71 100 49 8
Зависимость активности от рН субстрата (1 . сывороточного альбумина): рН: 6,0 .8,2 8,6 11,0
Активность, 7 i 47 66 78 100
Продукт растворим . Выход 98,0.1
+1,0 .
Пример 3. Готовят раствор протосубтилина по методике, описанной в примере 1. К 8 мл раствора протосубтилина (супернатанта) добавляют 40,0 мл 10,0 -ного раствора полиэтиленоксида 1500. Смесь облучают тормозным -излучением в дозе
2,3 мрад.
Свойства получаемого продукта.
Протеолитическая активность
120,0 ПЕ/мл.
Термостабильность.
t, Ñ: 37 45 50 60 70 80
Активность, : 40 49 70 100 48 8
Зависимость активности от рН субстрата (1 сывороточного альбумина): рН: 6,0 8,2 8,6 11,0
Активность, .: 50 65 71 100
%.
Продукт водорастворим. Выход 98,0 й1,0%.
Пример 4. Готовят раствор протосубтилина по методике, описан-. ной в примере 1. К 8 мл раствора протосубтилина (супернатанта) добав14425
Активность.7: 40 47 67 100 50 10
С: 37 45 50 60 70 80
Активность,X: 41 60 71 100 60 15
Зависимость активности от-рН субстрата (1 сывороточного альбумина): рН 6,0 8,2 8,6 11,0
АктивностьуХ: 53 69 70 100
С: 37 45 50 60 70 80 формула изобретения
Активность,Х: 38 51 70 100 45 11
Зависимость активности от рН субстрата (1 сывороточного альбумина): рН, 6,0 8,2 8,6 11,0
Активность,Х: 51 70 78 100
Продукт водорастворим. Выход
98,04.1,0 .
1 Составитель В.Иуронец
Редактор. Н.Гунько . Техред М.Дидык Корректор M.Âàñèëüåâà
Заказ 6355/23 Тираж 520 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ляют 40,0 мл 10,0 -ного раствора полиэтиленоксида 1500. Смесь облучают тормозным -излучением в-дозе
2,7 мрад.
Свойства полученного продукта.
Протеолитическая активность
80 ПЕ/мл.
Термостабильность.
Е, С: 37 45 50 60 70 80 10
Зависимость активности от рН субстрата (1 сывороточного альбумина). рН 6,0 8,2 8,6 11 0 15
Продукт водорастворим. Выход 98,0»+1, Q .
Пример 5. Готовят раствор про"
20 тосубтилина по методике, описанной в примере 1. К 8 мл раствора протосубтилина (супернатанта) добавляют
40,0 мл 10,0Х-ного раствора полиэтилеиоксида 600. Смесь облучают тормозным -излучением в дозе 2,5 мрад.
Свойства получаемого продукта.
Протеолитическая активность
85,0 ПЕ/мл.
Термостабильность.
Пример 6. Готовят раствор протосубтилина Г10Х по методике, описанной в примере 1. К 8 мл раство- 45
48 4 ра протосубтилина (супернатанта) добавляют 40,0 мл 10,0 -ного раствора полиэтиленоксида 2000. Смесь облучают тормозным -излучением в дозе
2,5 мрад.
Свойства полученного продукта.
Протеолитическая активность
110,0 ПЕ/мл.
Термостабильность °
Активность,Х: 56 80 81 100
Продукт водорастворим. Выход 98,0й
«1,0Х.
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получать иммобилизованный протосубтнлин с улучшенными качественными характеристиками, а именно с высокой протеологической активностью, с повышенной термостабильностью в присутствии субстрата и с расширенным рН-оптимумом активности.
Способ получения иммобилизованного протосубтилина, включающий взаимодействие раствора ферментного препарата .с органическим носителем, о г.— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения качества целецого продукта, в качестве носителя используют полиэтиленоксид с мол.массой 600...
2000 kD устанавливают соотношение носитель-фермент t:7,5 — 1:8,5 с последующим облучением смеси $ --лучами дозой 2,3-2,7 мрад. э
