Способ определения активности щелочной фосфатазы

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способам определения активности щелочной фосфатазы, и может быть использовано в иммуноферментном анализе, микробиологической промышленности, аналитической химии и т.л. Цель изобретения - увеличение чувствитепьности, упрощение и ускорение определения. В качестве субстрата используют восстановленный никoтинa шдaдeнивдинyклeoтидфocфaт, регистрацию продукта гидролиза ведут в ферментативной среде регенерации кофактора, содержащей алкогольдегидрогеназу из печени лошади и; два суб- . страта: этанол и п-нитрозо-М,м -димвтиламин, при этом в систему вводят амид салициловой кислоты. 4 ил 1 табл. с S (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1449588 А 1

<511 4 C 12 Q 1/32, G 01 N 33/535

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4238842/31-13 (22) 30.04.87 (46) 07.01.89. Бюл. Ф 1 (71) Институт биохимии им. А.Н.Баха и ИГУ им. М.В.Ломоносова (72) А.П. Осипов, Н.К. Гапонова, А.И.Егоров и И.В.Березин (53) 577.156(088.8) (56) EP 9 27036, G О1 N 33/54, 1981.

Self С.Н. Enzyme amplification— а general method applied to provide

an immunoassisted ussay for р1асепtal alkaline phosphatase. — I.Immunol. meth., 1985, v. 76, р.389-393. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЪ| (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения активности щелочной фосфатазы, и может быть использовано в иммуноферментном анализе, микробиологической пролышленности, аналитической химии и т.п . Цель изобретения — увеличение чувствительности, упрощение и ускорение определения. В качестве субстрата используют восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат, регистрацию продукта гидролиза ведут в ферментативной среде регенерации кофактора, содержащей алкогольдегид- Я рогенаэу из печени лошади и. два суб-, I страта: этанол и п-нитрозо-N,N -диметиламин, при этом в систему вводят амид салициловой кислоты. 4 ил, табл.

1449588

Изобретение относится к способам

on åäåëåíèÿ ферментов, а именно щело ной фосфатаэы, и может быть применено в иммуноферментном анализе разли4ных биологически активных соединений в клинической диагностике, в, микробиологических отраслях промышленности, аналитиЧеской химии и др.

Цель изобретения — увеличение чув- 10 ствительности, упрощение и ускоре. н определения активности щелочкой ф сфатаэы.

Способ осуществляют следующим об. р зом. 15

В кювету спектрофотометра вносят

0,9 мп 0,05 М трис-НС1 буфера рН 8.,59,1, содержащего 10 М MgC1, 100 мкл о ределяемого образца, НАДФН с кон чной концентрацией 10 — 10 M u

-7 Ф и кубируют 10-15 мин при 30-37 С. Посл этого в кювету добавляют 1 мп рас вора, содержащего в конечных конц нтрациях, M: АДГ иэ печени лошади

5 10 -10, п-нитроэо-N,N -диметил-7 К э5 а н (НДМА) 5 ° 10 -3 10 +, этанол 0,11 амид салициловой кислоты (АСК)

P 10 -5 10, ортофосфат натрия 0,05 в том же буфере, и определяют скvррсть фермектативной реакции io 30 увеличению оптической плотности п и 687 нм эа 1-3 мин. Контроль за ф новой реакцией в системе регенераи осуществляют аналогично укаэанном, но из системы исключается опред ляемый образец, Фоновая реакция протекает вследствие содержащегося примесного НАДН в субстрате НАДФН, а также неферментативного гидролиэа НАДФН за время мнкубаиди.

Эффект усиления в данной системе р егенерации кофактора достигается

=-1а счет циклического процесса окисления — восстановления НАД(Н) в ак ивном центре фермента с параллельным протеканием необратимых реакций окисЛекия спирта и восстановления НДМА.

Раствор НДМА имеет желтую окраску (% „ =: 440 нм), а при ферментативлом восстановлении он обесцвечивается.

Для удобства слежения за скоростью

1>еакции по возрастанию оптической плотности раствора от нулевого уровня в реакционную среду вводят АСК, который, взаимодействуя с продуктом

Восстановления НДМА, образует голубой краситель икдалин, имеющий максимум поглощения в видимой области спектра при 687 км.

По калибровочному графику зависимости скорости реакции от концектрации щелочной фосфатаэы в растворе можно с высокой чувствительностью определять содержание фермента в образце.

Предлагаемая система регенерации кофактора проще по сравнению с известной, так как. включает всего один фермент и позволяет определять НАД(Н) в минимальных концентрациях за меньший отрезок времени, Выбор АДГ печени лощади в качестве фермента регенерации обусловлен ее способностью осуществлять циклический процесс окисления — восстановления кофактора при участии двух сопряженных субстратов, в отличие от дрожжевой АДГ, используемой в известном способе, которая участвует только в восстановлении НАД и НАДН, при этом для регенерации НАД из НАДН требуется введение в систему второго фермента-диафоразы.

Выбор диапазона концентрации АЦГ обусловлен пропорциональным увеличением скорости реакции при возрастании концентрации АДГ в растворе. При со держании АДГ выше 10 Mi:в системе на-5 блюдается усиление фона реакции от примесного эндогенного НАД, содержащегося в препарата фермента, а тйкжЕ возникают трудности детектирования вследствие высоких скоростей реакции.

Диапазоны концентраций сопряженных субстратов - НДМА и этанола выбраны с учетом насыщения фермента по субстрату (>К ) и постоянства скорости ферментативной реакции.

Использование субстратов в концентрациях ниже указанных пределов приводит к пропорциональному снижению скоростей, а вьппе .- к непроизводительному расходу реагентов. АСК вводится в систему в большом избытке для достижения максимальной скорости взаимодействия с продуктом восстановления НДМА. Верхняя граница5 мМ обусловлена независимостью наблюдаемой скорости реакции при дальнейшем повьппении концентрации АСК в реакционной среде.

В качестве буферной среды в системе регенерации предлагается трис-НС1 с тем же рН, что и на стадии инкубации щелочной фосфатазы с субстратом

1449588

НАДФН. Наблюдаемая скорость ферментативной реакции в системе регенерации резко возрастает с увеличением рН .среды в интервале ?,2-9,1. Дальнейшее увеличение рН на изменение скорос. ти практически не влияет.Дпя сближения рН оптимумов действия щелочной фосфатазы и АДГ в данной системе выб" ран рН в интервале 8,5-9, 1, верхняя 10 граница которого лимитируется буферными свойствами трис-HCl. Использование трис-НС1 в качестве буфера в системе регенерации обусловлено тем, что он является хорошей ловушкой ин- 15 гибитора фермента — ацетальдегида, образующегося при окислении спирта.

Молекула триса (3-оксиметиламинометан) содержит в своем составе свободную аминогруппу, способную эффектив- 20 но связывать альдегид (с образованием шиффова основания), Дпя инактивации щелочной фосфатазы с целью проведения реакции во вторичной одноферментной системе регене- 25 рации с постоянной скоростью (ед. опт. пл/мин) в систему вводят ингибитор щелочной фосфатазы — ортофосфат натрия в конечной концентрации 0,05 М, Использование восстановленной фор- 30 мы НАДФН связано с его повышенной по сравнению с НАДФ стабильностью в щелочной среде. Содержание НАДФН в растворе варьирует в пределах 10

-Ф

10 М. Верхняя граница обусловлена независимостью ферментативной ско рости реакции от концентрации НАДФН, а также возможным возрастанием фоновой скорости реакции, нижняя — уменьшением ферментативной скорости и 40 как следствие снижением чувствительности определения щелочной фосфатазы.

На фиг. 1-4 приведены зависимости наблюдаемой скорости (ед.опт. пл . х 10 мин ) ферментативного вос- 45 становления НДМА в системе регенерации кофактора от концентрации С(М), щелочной фосфатазы в растворе в логарифмических координатах при различных рН буферной среды1фиг. 1 — рН 50

9, 1 (а), 8,5 (Ь), 8,0 (с)), при раз- личных концентрациях в системе НАДФН

1 фиг. 2-10 М (а); 4 ° 10 N (Ь); 5

«10 М (c)J, АДГ 1 фиг. 3 — 10 М (а);

2,5 10 М (Ъ), 5 ° 10 (с) (.

t l

II p и м е р 1. Определение активности щелочной фосфатазы в растворе

Г6 В в области концентраций 10 -10 М с использованием одноферментной системы регенерации кофактора.

Приготовляют растворы 0,05 трисHCl буфера рН 9, 1, содержащего: МяС1

10 М, НАДФН в концентрации 5 ° 10 М;

Ма РО 1 М; A@I 10 M в этом же буфере; этанольные растворы НДМА 44,5 мг/мл; АСК 20 мг/мл; стандартные растворы щелочной фосфатазы с удельной активностью 1000 U/ìèí мг белка в области концентраций 10 -10 М в

-<5 -и воде или трис-НС1 буфере рН 8,0.

В отдельной емкости готовят субстратную смесь, содержащую, мл: буфер 8,5, раствор НДМА О, 1, раствор

АСК 0,2, раствор Na РО41, раствор

АДГ 0,2, общий объем которой составляет 10 мп (на 10 анализов). В кювету спектрофотометра вносят 0,7 мл трис-HCl буфера, 100 мкл стандартно-, го раствора щелочной фосфатазы и

200 мкл раствора НЛДФН. Смесь инкубируют в кювете при 30 С 15 мнн, После этого в кювету добавляют 1 мл субстратной смеси и определяют возрастание оптической плотности за определенный промежуток времени (1 мин) при%, = 687 нм, что соответствует скорости ферментативной реакции (V; ед.опт.пл./мин) .

Полученная зависимость наблюдаемой скорости ферментативного восста" новления НДМА в системе регенерации кофактора от концентрации щелочной фосфатазы в инкубируемом растворе в логарифмических координатах приведена на фиг. 1 а ° Видно, что с увеличением концентрации щелочной фосфата" зы в области 10 -10 М, скорость ре 6 (3 акции в системе пропорционально возрастает. Вследствие того, что очень высокие скорости реакции в системе в области больших концентраций щелочной фосфатазы технически трудно измерить, определение активности проводят при уменьшении концентраций реагентов в системе (НАДФН, АДГ, НДЫ и пр.) или при снижении рН реакционной смеси, что уменьшает ферментативную скорость реакции.

Пример 2. Определение активности щелочной фосфатазы в растворе в области концентраций 10 -IO M c

)2 использованием одноферментной системы регенерации кофактора.

А. Приготовляют раствор 0,05 M трис-НС1 буфера рН 8,0. Растворы реагентов готовятся из тех же веществ и

1449588 к

Х в тех же концентрациях что н в пример6 1, но рН используемого трис-НС1 буфера равен 8,0, а конечная концент- рация НДМА в реакционной смеси состав- 5 ляет 5 i0 М. Определение активности

-6 щелочной фосфатазы проводят аналогично примеру 1. По полученным значениям строят калибровочную кривую зависим сти скоростей ферментативной реак- 10 и в системе от концентрации щелочи и фосфатазы .в логарифмических коорнатах (фиг. 1, кривая с), Б. Все растворы реагентов и субс1ратная смесь готовятся аналогично l5 и имеру 1 с использованием 0,05 М т ис-НС1 рН 9,1. В кювету спектрофот метра вносят 0,9 мл буфера, 0,1 мл с андартного образца и 10 мкл исход4го раствора НАДФН с конечной кон- 20 ц ентрацией в кювете 5- 10 М. Дальн ейшее проведение анализа выполняется а алогично примеру 1, при этом конечя концентрация АСК в системе сост авляет 2 ..10 М, Калибровочная крив ая (с) приведена на фиг. 2.

В. Буферный раствор и растворы реагентов приготовляются аналогично цримеру 1. Субстратная смесь "îòîâèòся так же, как в примере 1, но «"=,àóò 30

10 мкл исходного раствора АДГ с к неч ой концентрацией в системе 6 10 М и соответственно 8,7 мл буфера. Анаиз проводится согласно методике приера 1. Калибровочный график (с) заисимости скорости ферментативной пеакции в системе от концентрации и елочной фосфатазы приведен на фиг.3.

Таким образом, ферментативная сКО рость реакции в системе регенерации 40

Жофактора линейно возрастает с увеЛичением концентрации щелочной фосфатазы. При отклонении от оптимальНых условий определения щелочной фосфатазы в растворе (пример А-В) диапа- 5 зон измеряемых ее концентраций смеща Àñà в сторону больших величин почти на порядок.

Пример 3. Определение активности щелочной фосфатазы в исследуе- 50 иом образце с использованием однофер" ментной системы регенерации кофактора

Приготовляют растворы буфера, реагентов и субстратной смеси аналогично примеру 1. Определение активности щелочной фосфатазы в образце проводят аналогично примеру 1, отбирая по 100 мкл образца для каждого изме.рения вместо стандартного раствора фермента. Полученные значения cKQ рости реакции переносят на калибровочную кривую (фиг. 1, кривая а) .

Для более точного нахождения неизвестной концентрации щелочной фосфатазы в исследуемом образце строят калибровочный график зависимости скорости реакции от концентрации щелочной фосфатазы в растворе в нормальных координатах (V,åä,oïò.ïë./ìèí;

С,N), выбирая при этом соответст«вующий более узкий .диапазон концентраций щелочной фоефатаэы 10 -10 М в растворе (фиг. 4) .

Полученные значения концентраций фермента в определяемом образце по калибровочной кривой приведены в таблице. Коэффициент вариации значений составляет 7,5% °

Коэффициент вариации К

x1,00%. = 7 5%, Предлагаемый способ определения активности щелочной фосфатаэы отличается более высокой чувствительностью

<6 (до 10 М) по сравнению с известным

-15 (до О М), экономичностью (вместо двух ферментов в системе определения используется один — АДГ), а его проведение требует незначительных затрат времени (15-20 мин, в известном способе до 3 ч) .

Предлагаемый способ может найти широкое применение в твердофазном иммуноферментном анализе антигенов и антител при использовании щелочной фосфатазы в качестве. метки.

Формула изобретения

Способ определения активности щелочной фосфатазы, предусматривающий инкубацию определяемого образца с субстратом никотинамидадеииндинуклеотидфосфатом (НАДФ) в буферной среде с последующей спектрофотометрической регистрацией продукта гидролиза в фер ментативной системе регенерации кофак тора, включающей алкогольдегидрогенаэу (АДГ) и два субстрата, одним иэ которых является этанол, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения чувствительности, упрощения и ускорения споосба определения, инкубацию определяемого образца и регистрацию продукта гидролиэа, катализируемого щелочной фосфатазой, осуществляют в трис-HCl буфере рН 8,5-9, 1, 1449588 нитрозо-N N -диметиламин в концентрации 5 ° 10 -3 10 И, при этом в

6 систему вводят амид салициловой кис+ У

5 лоты в концентрации 2 ° 10 -5 ° 10 M и ортофосфат натрия до достижения концентрации 0,05 М.

НАДФ используют в восстановленной форме в концентрации 10 — 10 М, а в системе регенерации кофактора используют АДГ из печени лощади в концентрации 5 10 -1О М, а в качестве второго субстрата используют п"пределенные Среднее эна значения,Х;, чение, Х

М ° 10

2,6

1,90

0,04

0,19

2 05

2,8

2,54

2,45

1,79

2 55

1,86

2,3

1,75

Экспериментальная ско рость Ч,ед.. опт.пл./мин сперсия, Выборочное

° 10 стандратное отклонение

S õ 10!

449588

-15

1449588

V,еУ.олм лл/чжао

70 СРО®лу

Составитель А.Карякин

Редактор И.Горная ТехредЛ.Сердюкова Корректор Э.Лончакова

Заказ 6934/28 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4