Способ получения калиевой соли l-молочной кислоты

 

Изобретение относится к тонкому биотехнологическому синтезу, а именно к получению L-молочной кислоты, которая может быть использована для получения лекарственных препаратов, медицинских полимеров и химических катализаторов. Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта и повышение выхода L-молочной кислоты. Способ заключается в том, что проводят биотрапсформацию фумаровой кислоты в присутствии водного раствора КОН под действием соиммобилизованных в каррагинаповом геле клеток Lactobacillus casei БКМ В-536 и Escherichia coli ВК1ШВ-4024, причем клетки E.coli предварительно активируют обработкой раствором бромистого цетилпиридиния. 1 табл. SS

СООЗ СО8ЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9) (И) (51) 4 С 12 Р 7/56

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯЫ

ПРИ ГННТ СССР

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4258801/31-13 (22) 08.06.87 (46) 30.01.89. Бюл. У 4 (71) Институт биохимии им. А.Н. Баха и МГУ им. М.В. Ломоносова (72) И. Г. Газарян, В.А. Фечина, М.В. Федосеев, В.В. Карзанов, А.Н. Веревкин, В.И. Яковлева, А.М.Егоров, И,В. Березин, И.В. Авсюк, E.Н. Красильникова и Н.С. Егоров (53) 663.15(088.8) (56) Бокер М.Е. Введение в биотехнологию. М.: Пищевая промышленность.

1978, с. 145-146.

Заявка Японии У 52 -28231, кл. С 12 P 7/56, 1977. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛИЕВОЙ СОЛИ

L-МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к тонкому биотехнологическому синтезу, а именно к получению L-молочной кислоты биотра нсформацией фумаровой кислоты, которая может быть использована для 5 получения лекарственных препараторов, медицинских полимеров и химических катализаторов.

Цель изобретения — улучшение качества целевого продукта и повышение 10 выхода L-молочной кислоты.

Способ заключается в том, что проводят биотрансформацию фумаровой кислоты в присутствии водного раствора КОН, взятого в эквимолярном отношении к фумаровой кислоте, под действием соиммобилизованных в каррагинановом геле клеток Lactobacillus (57) Изобретение относится к тонкому биотехнологическому синтезу, а именно к получению L-молочной кислоты, которая может быть использована для получения лекарственных препаратов, медицинских полимеров и химических катализаторов. Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта и повышение выхода L-молочной кислоты. Способ заключается в том, что проводят биотрансформацию фумаровой кислоты в присутствии водного раствора КОН под действием соиммобилизованных в каррагинановом геле клеток Lactobacillus casei ВКМ

В-536 и Escherichia coli ВКПМ В-4024, причем клетки E.coli предварительно активируют обработкой раствором бромистого цетилпиридиния. 1 табл.

casei ВКМ В-536 и Escherichia coli

ВКПМ В-4024, причем клетки Е.coli 4 предварительно активируют обработкой раствором бромистого цетилпиридиния. 4е

Культивирование Ь. casei BKH  †5 ведут на стандартной питательной среде содержащей пептон, глюкозу, дрожже- 4h вой автолизат, добавки минеральных солей и L-яблочной кислоты, в течение 19 ч при 37 С и рН 6,0.

Полученную биомассу отделяют от питательной среды, например, центри—

Ъ фугированием, клетки отмыва:< т от питательной среды.

Культивирование Е.со11 ВКПМ В-4024 ведут на бульоне Хоттингера, cnqepжащем добавки NaCl, рН 7,0, в течение 24 ч при 30 С при перемешиваппи.

1454854

30

45

55

Полученную биомассу отделяют от питательной среды, например, центри" фугированием, отмывают от питательной среды и активируют раствором фумарата калия, содержащим 0,02% бромистого цетилпиридиния, в течение 20ч о при 30 С. По окончании активации клетки Е. col i ВКПМ В-4024 отделяют центрифугированием, отмывают и проводят их соиммобилизацию с L.casei

ВКМ В-536 в 5%-ном каррагинановом геле.

Соотношение клеток E.coli BKIIM

В-4024 и L.casei BKM В-536 на единицу объема биокатализатора определяют соотношением активностей исходных компонентов биокатализатора: фумаразной активности, клеток E.coli ВКПМ

В-4024 и малолактик-активности клеток L. casei BKM В-536. Фумаразную активность клеток Е.cali ВКПМ В-4024 определяют спектрофотометрически по убыли фумарата, активность малолактик-фермента в L, casei ВКМ В-536 определяют по накоплению L-лактата.

Для выбранных штаммов соотношение удельной активности клеток Е.coli

ВКПМ В-4024 и Ь.casei ВКМ В-536 составляет 10:1, подсчет клеток осуществляют в камере Горяева, 1 мл суспенло зии.L. casei BKM В-536 содержит 2 ° l o клеток, 1 мл суспензии Е.со1 БКПМ

В-4024 — 1,5 1 О" клеток. Для соиммобилизации,Е.coli BKIIM В-4024 и L.

casei BKM В-536 берут в соотношении числа клеток (клеточном соотношении), равном 1:1 — 1,5, при таком соотноше- . нии скоростьопределяющей стадией всего процесса является превращение яблочной кислоты в молочную, катализируемое L.casei ВКМ В вЂ 5. Уменьшение количества клеток L. casei BKM

В-536 на единицу объема иммобилизованного биокатализатора, которое происходит при изменении клеточного соотношения Е.coli ВКПМ В-4024 и

Ь. casei BKM В-536 в сторону увеличения содержания E.coli В-4024 до

7:1, приводит к снижению скорости всего процесса биотрансформации в целом. При понижении содержания Е. coli BKIIM  — 4024 до клеточного соотношения 1:20 и ниже скороатьимитирующей стадией процесса становится гидратация фумаровой кислоты в яблочную, что также приводит к снижению скорости общего процесса биотрансформации.

Гель с соиммобилизовапными клетками обрабатывают водным раствором, содержащим фумаровую кислоту и гицроокись калия в эквимолярном соотношении, при этом часть фумаровой кислоты находится в виде осадка. Количество осадка определяется концентрацией фумаровой кислоты, взятой для биотрансформации. р1! раствора составляет 4,5. В кислой среде происходит полное удаление углекислого газа, образующегося в процессе биотрансформации, накопление которого в растворе при щелочной реакции среды ингибирует процесс и понижает степень конверсии субстрата. Именно кислая реакция среды обеспечивает необратимость декарбоксилирования яблочной кислоты в молочную и тем самым способствует сдвигу равновесия гидратации фумаровой кислоты в яблочную в сторону полной конверсии фумаровай кислоты в продукты биотрансформации.

Использование меньшего количества

КОН приводит к значительному закислению реакционной среды вследствие образования молочной кислоты, инактивации биокатализатора и неполной конверсии субстрата в продукт. Эквимолярное соотношение фумаровой кислоты и гидроокиси калия обеспечивает образование лактата калия с выходом 100% и не содержащего свободной молочной кислоты.

Процесс биотрансформации ведут при 37 С, так как этот температур b ный режим является оптимальным для обеих использованных культур микроорганизмов, относящихся к группе мезофилов °

П р .и м е р 1. Культивирование клеток бактерии 1.actobacillus casei

ВКМ В-536 полученной из Всесоюзной коллекции микроорганизмов и описанной как Lactobacillus casei С 37, осуществляют в течение 1 6 ч при 37 С на стандартной среде, содержашей 5% дрожжевого автолизата, 0,5% L-яблочной кислоты, 1% глюкозы, 5% пептона, 0,3% ацетата натрия, 0,02%. сульфата магния, 0,005% сульфата марганца, 0,05% D,L — цистеина, 0,1% Tween 80, рН среды доводят гидроокисью калия до 6, О. Клетки осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение

20 мин. Клетки дважды отмывают от питательной среды 0,1 М Na, — фосфат— ным буферным раствором, рН 6,0 и

1454854 6

10 15

35

50 осаждают центрифугированием при

6000 об/мин в течение 20 мин, Выход биомассы с 0,5 л питательной среды составляет 3,5-4,2 мл суспензии, содержащей 2 10 клеток íà 1 мл.

Активность клеток 1.. casei BKM В-536 в реакции яблочно-молочнокислого брожения составляет 10 мкмолей/мин на 1 мл суспензия.

Культивирование клеток бактерии

Eschez ichia coli BKIIM B-4024, полученной из коллекции культур кафедры микробиологии Биологического факультета ИГУ и описанной как Escherichia coli 85, осуществляют на гидролизате бульона Хоттингера, содержащем 0,5Х хлористого натрия (рН среды равен 7,0) в течение 24 ч при

30 С и непрерывном перемешивании на качалке со скоростью 160 об/мин.

Клетки осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, суспендируют в 0,97.-ном растворе хлористого натрия и центрифугируют повторно в тех же условиях. Выход биомассы с 0,5 л питательной среды составляет 4 мл суспензии с концентрацией клеток 1,5 10" на 1 мл. Фумаразная активность клеток Е.coli

BKIIM  †40 составляет 100 мкмоль/мин на 1 мл суспензии клеток.

К 1 мл суспензии клеток Е.coli

ВКПИ В-4024 добавляют 25 мл 0,1 M раствора фумарата натрия и 0,25 мл

2i-íîãî раствора бромистого цетилпиридиния. Полученную смесь инкубируют при 30 С в течение 5 ч при слабом перемешивании. По окончании инкубации клетки осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, промывают 0,1 M Na-фосфатным буферным раствором, рН среды 6,0 и повторно центрифугируют.

1,5 мл суспензии клеток Е.coli

BKIIM В-4024, предварительно обработанных 0,02Х-ным раствором бромистого цетилпиридиния, как описано вышее, и L.casei ВКМ В-536, взятых в клеточном соотношении 1:1 (влияние клеточного соотношения на выход продукта представлено в таблице), (О содержащей приблиз ительно 6 ° 1 0 клеток, вносят в 5,5 мл 67.-ного раствора карраг)пюна в 0,1 M Na-фосфатн » бу-., фере рН 6,0 40 С и перемешивают, о

После охлаждения гель заливают 70 мл охлажденного О,) 11 К-фосфатного буфера, рН 6,0. Сформировавшийся гель .иэ»ельчают и в те ение 1 сут отмывают 0,1 М К-фосфатны» буфера», pfi б, О.

Соиммобилизованные клетки (7 мл геля) заливают 20»л реакционной смеси, содержащей 2 ммоль фумаровой кислоты и 2 ммоль гидроокиси калия.

Клетки инкубируют в реакционной среде в течение 24 ч при 37 С при слабом перемешивании. Выход молочной кислоты составляет 1003, продуктивность иммобилизованных клеток

1,1 мг/ч на 1 мл биокаталпзатора.

Пример 2. Выращивание и соиммобилизацию клеток Е.coli ВКПМ

В-4024 и L. casei BKM B-536 осуществляют как B примере 1. B качестве реакционной смеси используют 20 мл водного раствора, содержащего

10 ммоль фумаровой кислоты и 10ммоль гидрооксида калия ° 7 мл соиммобилизованных клеток заливают реакционной о смесью и инкубируют 72 ч при 37 С.

Выход молочной кислоты 100Х, продуктивность иммобилизованных- клеток

1,8 мг/ч с 1 мл биокатализатора.

Формула изобретения

Способ получения калиевой соли

L-молочной кислоты путем биотрансформации нерастворимого в воде субстрата с помощью двух культур микроорганизмов, о т л.и ч а ю шийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта и повышения выхода, в качестве культур микроорганизмов используют штамм Escherichia coli

BKIIM В-4024, активированный бромистым цетилпиридинием, и штамм Lactobacillus casei ВК11 В-536, соиммобилизованные в каррагинатовый гель в клеточном соотношении 1:1 — 1,5, а в качестве субстрата — фумаровую кислоту, при этом биотрансформацию ведут в присутствии гидроокиси калия, добавляемой в эквимолярном соотношении к фумаровой кислоте.

1454854

Соотношение числа клеток Е.со11, ВКПИ В-4024 и Ь.casei ВКИ

В-536, включенных в гель каррагинана

Показатель

7:1

1:1,5 I:20

Выход молочной кислоты, Х

I 00 I 00

Продуктивность, мг/ч на 1 мл биокатализатора

0,1

0,6 I,I 1,1

Составитель В..Варламов

Техред М. Ходанич

Редактор Н. Кнштулинец

Корректор С. Шекмар

Подписное

Заказ 7411730

Тираж 500

Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул . Проектная, 4

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д..4/5