Способ очистки культуральной жидкости микроорганизмов - продуцентов протеолитических ферментов

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу биотехнологии, и касается предварительной обработки ферментационных жидкостей в процессах получения очищенных ферментов. Цель изобретения - повышение качества и ускорение процесса очистки. Культуральную жидкость, полученную в результате ферментации продуцентов ферментов, подщелачивают до значения рН от 5 до 8, добавляют в качестве коагулирующего агента 3-5 г/л (по сухому веществу ) катионогенные водорастворимые полиэлектролиты поли-N,Н-диметил-Ы,N- -диаллиламмонгш хлорид или поли-4 (винил)-N-бензилтриметиламмоний хлорид , перемешивают от 5 до 10 мин с интенсивностью 50-70 об/мин, а затем выдерживают до образования осадка от 30 до 60 мин. Осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием с добавлением фильтроперлита. 2 табл. S (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51)4 С 12 11 l/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOIVIV СВИД :ТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

llPH ГКНТ СССР (21) 3960146/28-13 (22) 01.10.05 (46) 15.02.89. Бюл. N - 6 (7l) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) С.С. Фокина, Э.А. Иишкова, Л.И. Орещенко и .Н.В, Барсукова (53) 663.18(088.8) (56) .Авторское свидетельство СССР

М 975794, кл. С 12 N l/02, 1979.

Пусковой регламент на производство щелочной протеаэы. ВПО "Союзпромбелок", 1980. (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ КУЛЬТУРАЛЪНОЙ

ЖИДКОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ-ПРОДУЦЕНТОВ

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу биотехнологии, и касает-.

Изобретение относится к биотехнологии и касается предварительной обработки ферментационных жидкостей в процессах получения очищенных ферментных препаратов.

Цель изобретения — повышение каЧества и ускорение процесса очистки.

Очистку культуральной жидкости . (КЖ) осуществляют следуюцим образом.

Очистка КЖ начинается с разделения твердой и жидкой фаз. Разделение фаэ, 1 а также последующее выделение фермента, особенно при разработке сокращенных технологических схем, требует получения очиценных фильтратов КЖ повышенной степени чистоты, т,е. без коллоидных примесей, взвешенных со„„SU„„1458382 А 1 ся предварительной обработки ферментационных жидкостей в процессах получения очиценных ферментов. Цель изоб.. ретения — повышение качества и ускорение процесса очистки. Культуральную жидкость, полученную в результате ферментации продуцентов ферментов, подщелачивают до значения рН от 5 до

8, добавляют в качестве коагулирующего агента 3-5 г/л (по сухому веществу) катионогенные водорастворимые полиэлектролиты поли-N,N-диметил-N,N-диаллиламмоний хлорид или поли-4 (винил)-IJ-бензилтриметиламмоний хлорид, перемешивают от 5 до 10 мин с интенсивностью 50-70 об/мин, а . затем выдерживают до образования осадка от 30 до 60 мин. Осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием с добавлением фильтроперлита. 2 табл.

2 путствуюцих вецеств и посторонней

>РАЙ микрофлоры. Такую очистку КЖ можно Ю . достичь благодаря флокулянтам. 00

По окончании ферментации в КЖ, СА представляющую собой многокомпонент- (,ф .ную полидисперсную систему перемен.:д- Я го состава (в зависимости от питательной среды), вносится флокулянт .на основе диметилдиаллиламмоний хлорида (ВПК-402) или винилбензилтриме- е тиламмоний хлорида (ВПК-101) (катиогенные полиэлектролиты). Предварительно рН КЖ доводят до рН 5.0-8,0 в зависимости от фермента. Эта величина влияет как на скорость процесса, так и на сохранение активности фермента, так как флокулянты, являясь

145838 полиэлектролитами, могут взаимодействовать с ферментным белком, вызы.вая его коагуляцию, поэтому для каж4 дого фермента эта зона индивидуальна.

Так, для нейтральной протеазы оптимальным параметром является рН 6,57,5, для щелочной — рН 7,5-8,0, для кислой протеииазы — рН 5,0-6,0.

Выбор параметров при коагуляции биомассы с помощью флокулянтов обуславливается не только свойствами того или иного фермента (последнее имеет ,определяющее значение, так как зави,сит от заряда клетки микроорганизма и его морфологических свойств, от ,состава и физико-химической характе- ристики культуральной жидкости в целом}, но и свойствами того или иного флокулянта. 20

Флокулянт необходимо вносить по содержанию сухих веществ в товарном

1 продукте в количестве 0,3-0,5% от объема КЖ. Внесение флокулянта в концентрации меньше 0,3% нецелесообраз- 25 ,но, так как скорость фильтрации падает. Дальнейшее увеличение концентрации свыше 0,5% не улучшает процесса, а эффективность процесса снижается.

Используемый флокулянт выпускается с содержанием сухих (основного продукта) веществ 10-50%.

Оптимальные результаты очистки

КЖ получены при концентрации поли-! электролита 0,3-0,5%. Это количество флокулянта способствует не только ко агуляции биомассы, вз вешенных в растворе сопутствующих веществ и очистке ферментного раствора от тонкодисперсных частиц, частичному удалению посторонней микрофлоры, а также сохранению суммарной исходной ферментативной активности раствора.

На этой стадии флокулянт проявпяет своиство и как известного реагента- 4> коагулятора, и как стабилизатора-активатора фермента.

Сохранение и даже увеличение активности фермента в отфильтрОванной

КЖ связано с тем, что флокулянт:выво- 0 дит из исходных растворов ингибиторы ферментов, что позволяет сохранить и увеличить ферментативную актив . ность °

При внесении флокулянта в Kp{ для его полного внесения последний разводят 2-5 объемами воды. Затем смесь (КА{ с флокулянтом) перемешивают в течение 5 — 10 мин для того., чтобы о6ес2

4 лечить равномерное движение объемов раствора с активными центрами полиэлектролита, где происходит столкновение и слипание частиц.

Для полноты осаждения биомассы, растворенных и нерастворенных примесей, т.е. для формирования осадка, указанную смесь выдерживают без перемешивания 30-60 мин. Далее очищаемый раствор подают на центробежное оборудование и биомассу отделяют при том рН, которое установилось после внесения флокулянта и выдержки смеси. Если используется фильтровальное оборудование для отделения биомассы, то перед внесением флокулянта вводят 1,52% фильтроперлита.

Осуществление предлагаемого способа позволяет увеличить скорость фильтрации до 120 — 150 л/м ч, т. е. в 1,52 раза по сравнению с известным способом.

Предлагаемый способ обеспечивает чистоту нативного раствора, снижает содержание посторонней микрофлоры на 2-3 порядка (см. табл. 1), Пример 1 (контрольный).

Очистку КЖ щелочной протеазы осуществляют растворами солей хлористого кальция и фосфатов с фильтроперлитом, По окончании ферментации бактериальную КЖ, содержащую щелочную протеазу, в количестве 10000 л охлаждают до 13 С, доводят рН до 6,2 раствором едкого натра, добавляют 900 кг фильтроперлита и вносят 500 кг хлористого кальция, предварительно растворенного в 770 л воды и перемешивают в течение 15 мин. При этом рН КЖ понижается до 4„8, его повышают до 5,6 раствором едкого натра, который приготавливают заранее (2400 л воды +

600 л 36%-ного раствора. NaOH или

127 кг кристаллического едкого натра).

Затем в эту смесь загружают 160 кг динатрий фосфата и 240 кг тринатрий фосфата, предварительно растворенных в 1200 л воды, подогретой до 40 С.

КЖ с солями и фильтроперлитом перемешивают в течение 15 мин, рН доводят до 6,4 раствором NaOH при включенной мешалке, затем отключают мешалку и выдерживают без перемешивания в течение 2 ч. Исходная активность щелочной протеазы 8000 ед/мл, содержание микрофлоры 5 -10 кол/мл. Процесс отделения твердой фазы от жидкой проводят на ленточных фильтрах, 1458382 на которые наносят слой фильтроперлита (около 500 кг для намывки на ткань 1 фильтра). Общий объем фильтФ рата с промывными водами составляет . 12800 л, активность 4680 ед/мл, содержание микрофлоры 10 кол/мл, по9 лученный фильтрат имеет коэффициент осветления 65Х. Общее количество отделяемой биомассы с солями составляет

2750 кг (в отвал). Затраты времени на проведение технологических операций (подщелачивание, обработка солями) 10 ч; скорость фильтрации

80 л/м ч. Потери активности составляют 25%. Снижения содержания микрофлоры нет.

Пример 2. Очистка КЖ щелочной протеазы .с использованием флокулянта.

После окончания процесса ферментации 10000 л КЖ Bacillus subtilis шт. 72 с активностью 8000 ед/мл и содержанием микрофлоры 3 ° 10 кол/мл з подщелачивают до рН 8,0 раствором едкого натра, добавляют флокулянт ВПК402 в количестве 0,4% (по сухому веществу) от объема КЖ. Флокулянт разводят водой в соотношении 1:5.

Смесь перемешивают 10 мин, остав-.. ляют без перемешивания на 30 мин.

Процесс отделения скоагулированной биомассы проводят сепарированием.. Общий объем очищенного фильтрата составляет 9400 л с активностью

8120 ед/мл, содержание микрофлоры

2 10 кол/мл, коэффициент осветления

90%. Общее количество отделяемой биомассы 585 кг, его можно использовать на корм скоту. Затраты времени на . подщелачивание и обработку флокулянтом 1,5 ч. Производительность сепариравания 0,4-0,5 м /ч.

Таким образом, в сравнении с известным способом по предлагаемому способу потерь ферментативной активности от инактивации нет, наблюдается повышение активности íà 129 ep/ìë в фильтрате по сравнению с исходной активностью, снижается содержание посторонней микрофлоры на 3 порядка, повышается прозрачность фильтрата (осветление) на 25%, исключается полностью использование дефицитного сырья (фильтроперлита, солей фосфатов), сокращается время обработки

КЖ с 10 до 1,5 ч, уменьшается в 4 раза количество отделяемой биомассы.

Данные по примерам l и 2 сведены в табл. l.

l5

II р и м е р 2. 200 мл КЖ щелочной протеазы с активностью 3570 ед/мл и содержанием микрофлоры 10 - кол/мл, подцелачивают до рН 8,0 ° Так как отделение скоагулированной биомассы проводят фильтрованием под вакуумом на воронке Бюхнера, то вносят l 5% фильтроперлита, затем вносят флоку ;и лянт BIIK-4.,2 в количестве 0,3% (1,8 г на 200 мл ЮК или 9 г/л). Фпокулянт для полного внесения в КЖ растворяют 2 объемами воды.

Смесь перемешивают 5 мин, остав ляют без перемешивания .на 30 мин.

Затем отфильтровывают. Скорость фильтрации 130 л/м ч. Объем фильтрата составляет 189 мл. Ферментативная активность щелочной протеазы

38бб ед/мл. Содержание .микрофлоры снижается на 4 порядка (2 ° 10 кол/мл), прозрачность фильтрата (козффициен"

Из .табл. 1 видно, что при 1 оагуляции биомассы гелем фосфата кальция выход на стадии отделения, биомассы составляет 75Х, а с использованием флокулянта 95Х (5% — это механические потери). Если рассматривать действие коагулянтов на фермент, то по известному способу наблюдается инактивация активности на 5,8%, а при использовании флокулянта ВПК-402 наблюдается повышение ферментативной активности в 1 мл фильтрата по сравне|п1ю с исходной °

Лабораторные испытания способа.

Пример l. 300 мл КЖ Bacillus

subtilis шт. 72 с активностью

6274 ед/мл и содержанием микрофлоры

3 10 кол/мл, рН 6,4, подщелачивают

3 до рН 7,5 раствором едкого натра, добавляют флокулянт ВПК-402 в количестве 0,5% (по сухому веществу, со.держание которого в данном случае составляет 31,8%) от объема КЖ. Это составляет 15,3 г/л или 4,6 г на

300 мл КЖ. Предварительно флокулянт разводят водой в соотношении l 3.

Смесь перемешивают 10 мин, оставляют без перемешивания на 40 мин.

Отделение скоагулированной биомассы проводят центрифугйрованием. Общий объем очищенного фильтрата составляет 290 мл с активностью 6800 ед/мл, содержание микрофлоры 10 кол/мл, ко4 эффициент осветления 92%. Активация

1 мл фильтрата после контакта с фло" кулянтом составляет 8,3%.

7.. 14 осветления) 89%. Активация фермента

8, 2%.

11 р и м е р 3. По окончании ферментации КЖ Bacillus subtilis шт.103, е содержащую нейтральную протеазу, в . количестве 500 мл доводят до рН 6,5.

Исходная активность нейтральной протеазы 14,0 ед/мл. Добавляют 0,4% флокулянта ВПК-402 (в пересчете на сухое вещество 6 г). Флокулянт раство ряют 2 объемами воды. Смесь переме, шивают 10 мин, оставляют в покое на 60 мин для полного формирования фло. кул, после чего образовавшийся оса. док отделяют центрифугированием. Ис ходная КЖ имеет обсемененность

1 0 кол/мл. Затраты времени на проведение технологических операций (до ведение рН, внесение растворенного, .полиэлектролита, перемешивание и вы, держка смеси) 1,5 ч. Очищенный. фильтрат в объеме 469 мл содержит

15,7 ед/мл, содержание посторонней микрофлоры 2 10 кол/мл, коэффициент осветления 84%. Активация фермента

1 2%.

Пример 4. 250 мл КЖ, содержащей нейтральную протеазу, подщелачивают до рН 7,5. Добавляют 2% фильтроперлита и 0,5% (по сухому веществу) флокулянта ВПК-IОI, т.е. 20 г/л, так как флокулянт содержит 25% сухих веществ. Смесь перемешивают 5 мин, за-. тем выключают мешалку и оставляют без перемешивания 50 мин, Скоагулированную биомассу отделяют фильтрованием. Скорость фильтрации 150 л/м ч, 2.

Исходная активность нейтральной протеазы составляет 12 4 ед/мл, в отфильтрованном растворе 1.3,6 ед/мл.

Активация фермента 9,6%. Содержание бьем номассы

1 м1

КЖ в кг

Козф- Обсефициент мененосвет" ность> пения,Е кол/мл

Активность протеазы

Стадия Объем, л

Выход, Степень

Х очистки в ) мл удельная, ед/мг белка

Контроль (обработка по известному способу) 10 275

1„В

8 1 6

100 1

l0l7 75 1,2

Предлагаемый способ

816 100 1 l0 58

1,6

1310

90 10

Исходная культуральная жидкость 10000 . 8000

Фильтрат 12800 4680

Исходная культуральная жидкость 10000 8000

Фнльтрат 9400 8120

58382 8 микрофлоры снижается на 2 порядка.

Коэффициент осветления "89% .

Пример 5. К КЖ нейтральной протеазы (300 мл) с рН 7,0 добавляют флокулянт. ВПК-402 в количестве

0,45%, что составляет 16,8 г/л, затем перемешивают 10 мин, оставляют без т1еремешивания 30 мин. Отделяют скоагулированную биомассу центрифугированием. Исходная активность КЖ

11 5 ед/мл, содержание микрофлоры

10 кол/мл . Фильтрат в объеме 285 мл

3 имеет активность 12,6 ед/мл и обсемененность 10 кол/мл, прозрачность

91%.

Результаты испытаний приведены в табл ° 2.

Формула изобретения

Способ очистки культуральной жидкости микроорганизмов — продуцентов

25 протеолитических ферментов, предусматр1 вающий регулирование значения рН среды, осаждение .биомассы путем добавления коагулирующего агента, перемешивание, выдерживание до максимального образования осадка с последующим его отделением, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения качества и ускорения процесса очистки, значение р11 среды устанавливают до 5-8, в качестве коагулирующего агента. используют катионогенный водорастворимый полиэлектролит поли-N,N-диметил-N,N-диаллиламмоний хлорид или поли-4(ви- .

40 нил)11-бензилтриметиламмоний хлорид в количестве 3-5 г сухого вещества в 1 л культуральной жидкости, Таблица 1