Способ определения состояния в-системы иммунитета

 

Изобретение относится к иммунологическим методам исследования и может быть использовано для выявления активации В-системы иммунитета. Цель изобретения - повьпление точности способа . Для оценки состояния В-системы иммунитета определяют изоэнзимный спектр лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в В-лимфоцитах периферической крови и по коэффициенту соотношения величин активности ЛДГ,: ЛДГ, (Кс) судят о состоянии В-системы. Значение коэффициента выше 1,45 свидетельствует об активации- В-системы иммунитета. Положительный эффект предлагаемого способа заключается в его большей точности по сравнению с известным, используя который, не всегда удается выявить активацию В-системы, т.к. противоположная направленность изменений активности изоэнзимов может не привести к изменениям общей активности лактатдегидрогеназы. с $ (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

1 А1

„.Я0„„14 (51)4 Г 01 N 33/53/ G Ol N 33/561

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHGMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4205408/28-14 (22) 02.03.87 (46) 23.03,89, Бюл, М 11 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови и

Минский государственный медицинский институт (72) В.И.Левин, Г..П.Матвейков, Е.С.Калия и Н.M.Càíüêî (53) 615.375(088.8) (56) Иммунология,1983, 1 - 3, 43-46 ° (54) ПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ

В-СИСТЕМЫ И1Ф1УНИТЕТА (57) Изобретение относится к иммунологическим методам исследования и может быть использовано для выявления активации В-системы иммунитета, Цель изобретения — повышение точности споИзобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено для выявления активации В-системы иммунитета, Цель изобретения — повышение точности способа определения состояния

В-системы иммунитета.

Способ осуществляют следующим образом.

Лимфоциты периферической крови выделяют в градиенте плотности фиколлверографина. Общую популяцию лимфоцитов разделяют на Т- и В-фракции

I любым из принятых в лаборатории методов розеткообразования или сепарацией на нейлоновой вате, Полученные В-клетки доводят изотоническим раствором хлористого натрия до концентрации

1 10 в 1 мл. Клетки разрушают по ме1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР соба. Для оценки состояния В-системы иммунитета определяют изоэнзимний спектр лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в

В-лимфоцитах периферической крови и по коэффициенту соотношения величин активности ЛДГ,: ЛДГ> (К ) судят о состоянии В-системы, Значение коэффициента выше 1,45 свидетельствует об активации В-системы иммунитета.

Положительный эффект предлагаемого способа заключается в его большей точности по сравнению с известным, используя который, не всегда удается выявить активацию В-системы, т.к. противоположная направленность изменений активности изоэнзимов может не привести к изменениям общей активности лактатдегидрогенаэы.

2 тоду, принятому в лаборатории, например замораживанием — оттаиванием, Для разделения изоэнзимов лактатдегид-. рогеназы (ЛДГ) в В-клетках используют метод энзимов электрофореза в полиакриламидном геле. Активность изоэнзимов ЛДГ оценивают денситометрически.

После чего высчитывают коэффициент соотношения вйличин активности

ЛДГ„: ЛДГ > (К,) путем деления величины активности ЛДГ, на величину активности ЛД! .

Пример . Донор А. проиммуниЗм зирован к резус-антигену, титр резусантител l:512. Из локтевой вены взято

20 мл крови на консерванте.

Кровь осторожно наслаивают на смесь фиколл-верографин и центрифуги-; руют 30 мин при 1500 об/мин. Образо15

ЛДГ остается без изменений.

Формула и з обретения

Составитель M,Губарев

Техред И. Верес. Корректор Л, Пилипенко

Редактор Н. Тупица

Заказ 1192/43

Тираж 788

Подписное

8}gggIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101

3 14675 вавшееся кольцо лимфоцитов осторожно собирают пипеткой в центрифужную пробирку и отмывают дважды раствором

Хэнкса по 10 мин при 1500 об/мин.

Осадок лимфоцитов ресуспендируют в среде 199, содержащей 5Х инактивированной телячьей сыворотки, доводя концентрацию лимфоцитов до 8—

10 10 в 1 мл. Количество лимфоцитов 10 определяют путем подсчета под микроскопом в камере Горяева. Разделение лимфоцитов на Т- и В-популяцию проводят на колонках с нейлоновой ватой, В-лимфоциты разрушают путем 10"крат» 15 ного замораживания (-20ОС) и оттаивания (18-20 С).

Электрофорез изоферментов ЛДГ в полиакриламидном геле проводят на аппарате для вертикального гель-элек- 20 трофореза. Исследуемую взвесь разрушенных ли. :фоцитов в количестве

0 1 мл наносят в трубочки, заполненные гелем. Сверху осторожно наслаивают трис-буфер, трубочки закрепляют в катодной камере аппарата. В катодную и анодную камеры заливают по

1 л трис-буфера (рН 8,3). Продолжительность электрофореэа 2 ч в холо- . дильнике (4-8 С). Извлечение геля проводят,в кювете с водой под давлением из шприца. Гель промывают водой, помещают в пробирки и заливают краской, прогретой до 37О0.

Состав краски: Li — лактат (288 мг 35 в 3 мл H 0), НАД (45 г в 1,5 мл Н О), NaCl (0,1 M — 3 мл), MgClz (0,1 M—

3 мл), фосфатный буфер (pH 7,4-7,5), нитротетразолевый синий (15 мг в 4мл

Н О) и непосредственно. перед заливкой 0 добавляют ФМС (феназинметасульфат) (1%-ныл раствор — 0,75 мл). Пробирки ставят в термостат и выдерживают для развития окраски в течение 1 ч при

37 С. После акрашивания изоферментных фракций гель промывают водой и заливают 7%-ным раствором уксусной кислоты. Активность иэоферментных фракций определяют денситометрически. У донора А, величина активности ЛДГ, 30,85Х, ЛДГ z 12,77%, ЛДГg 46,81%, ЛДГ

5,32%, ЛДГ 4,26%, Высчитывают коэффициент соотношения ЛДГ„: ЛДГ, который составил 7,24. У здоровых лиц К равен 1,01+0,44, Следовательно, согласно предлагаемому способу у донора выявлена активация В-системы иммунитета.

Положительный эффект предлагаемо го способа состоит в обеспечении большей точности в выявлении активации

B-системы иммунитета по сравнению с известным, поскольку увеличение активности одной из фракций изофермента свидетельствует об активации В-системы иммунитета, хотя общая активность

Способ определения состояния

В-системы иммунитета путем выявления активности лактатдегидрогеназы В-лимфоцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, с помощью электрофореза выявляют активность изоферментов лактатдегидрогеназы ЛДГ,, ЛДГ, ЛДГз, ЛДГ и ЛДГ, далее устанавливают соотношение между показателями, максимально различающимися по электрофоретический подвижности, и при значении коэффи-; циента 1,45 и вьппе определяют активированное состояние В-системы иммунитета.