Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к липополисахариду еsснеriснiа coli

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения антигена ESCHERICHIA COLI в препаратах частично очищенного рекомбинантного интерлейкина - 2 (рил-2) человека, а также для его очистки. Цель изобретения - получение гибридного штамма, продуцирующего моноклональные антитела к липополисахариду E.COLI. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BA1B/C, иммунизированных РИЛ-2 человека, с клетками миеломы X63-AG8-653. Клетки культивируют, и через 2-3 дня секреция МкАТ составляет 40-45 мкг/мл культуральной жидкости. МкАТ относятся к классу JGZ1, специфически взаимодействуют с липополисахаридом /ЛПС/ E.COLI. МкАТ могут быть использованы для определения ЛПС в препаратах частично очищенного РИЛ-2, а также его очистки от ЛПС.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„.,яа„д72497 (51) 4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ХОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И. ОТНРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4251938/28-13 (22) 28.05.87 (46) 15.04.89.. Бюл.II 14 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови (72) А.В.Панютич, Н.Н.Войтенок, А.Ю.Циманис, 10.Ï.Бундулис и В.А.Скривелис (53) 578.085.23(088.8) (56) Baker R,S, et al - . тапсе ", 1981, ч, ii, р, 1139-1142, Anicetti U.R. et al — J. Immunology Methods> 1986, v. 91, р. 213-224. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

KJIET0K ЖИВОТНЫХ MUS NJSCULVS, ИСПОЛЬ»

ЗУЕМЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ MOHOKJIOHAJIbHbIX

АНТИТЕЛ К ЛИПОПОЛИСАХАРИДУ ESCHERICHIA

COL I (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения антигена Escherichia

coli в препаратах частично очищенного рекомбинантного интерлейкина-2 (РИЛ-2) человека, а также для его очистки, Цель изобретения - получение гиб .. ридного штамма, продущирующего моно-., клональные антитела клипополисахариду °

Е,coli.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии ВаХв/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД

P ИЛ-2 человека в 0,15 мп 0,15 М

NaCl в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда, Иммунизации повтоопределения антигена Eschcrichia

coli в препаратах час1ично очищеннсго рекомбинантного интерлейкина-2 (РИЛ-2) человека, а также для его очистки. Цель изобретения — получение гибридного штамма, продуцирующего моноклональные антитела клипополисахариду Е.coli, Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/å, иммунизированных РИЛ-2 человека, с клетками миеломы Х63-Ag8"653. Клетки культивируют, и через 2-3 дня секреция МкАТ составляет 40-45 мкг/мл культуральной жидкости. МкАТ относятся к классу IgT.I специфически взаи" модействуют слипополисахаридом (ЛПС)

Е,coli. МкАТ могут быть использованы для определения ЛПС в препаратах частично. очищенного РИЛ-2, а также его очистки от ЛПС, 2 ряют 3 р as а через 14 дней тем же количеством антигена в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. За 3 дня до сли" ф яния Р ИЛ-2 вводят внутрибрюшинно в 0,5 мп 0,15 M NaC1. Гибридизацию

1 х10 клеток селезенки иммунных мышей и 3 101 клеток миеломы мыши Х63-Ая8-653 проводят 50Х-ным раствором полиэтиленгликоля (молекулярной массы

4000), содержащего 57. диметилсульфоксида, в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля, клетки высевают в

96-луночные панели по Ii10 спленоци- тов в лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду

ТМДМ (модифицированная Isrove s сре"

4 лячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, ! 00 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола, при 37 С и в атмосфере 57 CO 2.

Культуральные свойства. Для выра-. щивания штамма использовали стеклянную посуду, посевная доза — 200 тыс. клеток на миллилитр, клетки пассировали один раз в 2-3 дня, кратность рассева — 1:6 — 1:8. Культура суспен« эионная.

Культивирование в организме животных. Для выращивания асцита пригодны мыши Ваяв/с. Мышам эа 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5х10 клеток в 1 мл среды IMAM. Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма.

Секреция моноклонального антитела (МкАТ) на 2-3 день культивирования составляет 40-45 мкг в 1 мл культуральной среды и 15-20 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.

Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует моноклональное антитело., с изотипом IgLI. Специфичность — антиген Е.coli небелковой природы,.содержащийся в препарате P

ИЛ-2 человека. Методы оценки сохранения специфичности: тест на связывание МкАТ с частично очищенным Р ИЛ-2 (иммуно-ферментный анализ), Стабильность продукции. Продукция

МкАТ сохраняется как минимум до 10 пассажей in vitro. В асцитной форме штамм не-пассировался более одного раза, Криоконсервирование, Для длитель-. ного хранения клетки штамма заморажи вают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 107 диметилсульф оксида. Режим замораживания: 1 С в

"минуту до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание — на водяной бане при о

+37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания — 40-507 по окрашиванию трипановым синим, Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питатель-ные среды. Заражение микоплазмой не выявлено по характеру включения тимидиновой метки.

Культуральные признаки.

Стандартные условия культивирова-. ния: среда. 1МДМ с 107. донорской тез 147?49 да Дульбекко) с добавлением 107. эмбpHoHBJIbHoH телячьей сыворотки (ЭТС), 10 М гипоксантина, 4 х10 М аминоптерина и 1 6 «10 М тимидина. Гибри—

Ф

5 домы-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4 <10 клеток селезенки. После 2 клонирова-.. ний практически 1007. субклонов проду- 10 цируют моноклональные антитела (SKAT) к антигену Е.coli. Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 10 пассажей в культуре. Сре" да для культивирования — ТИДМ с 107 (ТС, 2 мМ I,-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере

57 углекислоты. Посевная доза—

2 10 клеток в мл. Через 2-3 дня 20 концентрация антител в культуральной жидкости достигает 40-45 мкг/мл.

Контаминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена. Для длительного хранения гибридомные клетки 25 могут быть заморожены в ЭТС с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1ОС в минуту до

-70 С, после замораживания клетки переносят в жидкий азот. Клетки раз- 30 мораживают, перенося иэ жидкого азота в водяную баню на 37 С.

Для выращивания гибридомного штамма в асцитной форме клетки вводят внутрибрюшинно MbIIIIBM Ваяв/с, обработанным пристаном, в количестве 2-5 х10 клеток на мышь. Асцит созревает на 12 — 14 день.

Моноклональные антитела, продуцируемые клетками штамма 3351.2, отно- 40 сятся к IgLI подклассу и связываются с липополисахаридом Е.coli. Специфичность взаимодействия МкАТ с антиге-, ном Е,со1i может быть выявлена способом, при котором частично очищенный 45

P ИЛ-2 и белки Е,coli (обработанные и необработанные протеиназой К) используются в качестве антигенов (твердофаэный иммуноферментный анализ).

Полученный штамм обозначают

ЗЗБ1.2, он хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии AH СССР под номером ВСКК (II)IIID и характеризуется следующими

55 приз н ак ами .

72497 6 ляют ортофениленди амин гидрохлорид

0,6 мг/мл в цитратнофосфатном буфере рН 4, 7, содержащем О,ОЗХ Н 0 . Реакцию останавливают через 10 мин 1 M серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты опыта свидетельствуют о высокой специфичности МкАТ к липополисахариду Е.coli, что позволяет испольэовать МкАТ для определения последнего в препаратах рекомбинантного ИЛ-2 человека.

Пример 2. 5 мг сульфатной фракции асцита штамма ЗЗБ1.2 связывают с 1 мл CNBr — активированной сефа". розы 4В.: На колонку наносят 0,5 мг частично очищенного P ИЛ-2 в 8 мл

2Р ЭФР .

Относительное содержание P ИЛ-2,липополисахарида E cori после сорбции определяют на основании данных иммуноферментного анализа с антигенами, иммоби25 лизованными на пластике (пример 1) .В ка честве антигенов используют серииные разведения исходного образца P ИЛ-2 и элюата, в качестве первых антителМкАТ штамма 26Б1. 2, реагирующие с

З0 Р ИЛ-2, и МкАТ штамма ЗЗБ1.2.

Результаты опыта по удалению липополисахарида Е.coli из препарата частично очищенного P ИЛ-2 иммобилизованными антителами штамма ЗЗБ1.2 показывают, что содержание ЛПС Е.coli в элюате менее 10Х à P ИЛ-2 — 81Х.

Эти данные свидетельствуют о воэможности использования МкАТ штамма

ЗЗБ1,2 для очистки P ИЛ-2 человека.

5 14

Использование штамма иллюстриру ется следующими примерами.

II p и м е р 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по 1<10 клеток в 5 мл среды IMIIM c 10 ЭТС, 2мМ L-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола °

Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмсфере 5 . СО . Полученный супернатант используют.в качестве реагента в иммунохимических реакциях (как препарат МкАТ). Для проведения иммуноферментного анализа антигены высушивают в лунках 96-ячеечных микроплат при 37 С или 20 С в следующих количествах: частично очищенный Р

ИЛ-2 — 150 нг в 20 мкл. бидиатиллиро ванной воды; мембранная фракция

Е.coli бычий сывороточный альбумин (БСА), дрожжевой Т-PHK (ВДН) по l мкг в 20 мкл бидистиллированной води, протеиназа К вЂ” 0,5 мкг в 20 мил бидистиллированной воды. Для выделения бактериальных липополисахаридов (ЛПС) частично очишенный P ИЛ-2 и мембранную фракцию Е.coli обрабатывают протеинаэой К (Пр К) в течение часа при 60 С. Депротеинизированные антигены в эквивалентном количестве с необработанными антигенами высушивают в лунках микроплаты из 20 мкл бидистиллированной воды. После отмывки в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды штамма ЗЗБ1.2 или разведенных до концентрации 1 мкг/мл в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaC1, 1Х БСА (ЗФР-БСА) МкАТ

MAC-003, специфичных клеточному ИЛ-2.

Панель инкубируют 2 ч при 20 С, затем отмывают бидистиллированной водой и вносят по 50 мкл/лунку кроличьи антимьппиные антитела, меченные пероксидазой, разведенные 1/2500 в ЭФР-БСА.

После инкубации в течение 1 ч при

20 С плату отмывают и в лунки добав40

Формула и s обр етения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK(II)

N lllD используемый для получения

45 моноклональных антител к липополисахариду Escherichia coli.

Составитель Г. Смирнова

Техред M,Дидык

Корректор Н, Гунько

Редактор И. Сегляник

Заказ 1673/27 Тираж 501

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r .Óæãoðîä, ул. Гагарина, 101