Способ определения антител к гаптенам

 

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к иммунологии. Целью изобретения является упрощение способа определения антител иммуноферментным методом. Цель достигается тем, что при конъюгации гаптена с белком-носителем в качестве последнего используют кроличий или яичный альбумин, который адсорбируют на поверхности твердой фазы.

COI03 СОВЕТСНИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11>

А1 (51)4 G 01 N 33/53 33/544

В ЕСаазщя

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTGPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (2I) 4081142/28-14 (22) 24.06.86 (46) 30.05,89. Бюл. N"- 20 (71) Восточно-Сибирский технологический институт (72) Г.Л.Тумуров и С.С,Тармакова (53) 615.373(088.8) (56) Т. Immunopharmacology, 1983, 5, 1(- 3, р.211-2)8.

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, в частности, иммунохимического анализа гаптенов и антител против них.

Целью изобретения является упрощение способа определения антител иммуноферментным методом.

Способ осуществляют следующим образом, Белки-носители в концентрации

0,02 мг/мл в 0,1 М натрий-карбонат-:. ном буфере (НКБ) рН 8,0-9,6 заливают по 0,2 мл в лунки иммунологических полистироловых планшетов и инкубируют

4-6 ч при комнатной температуре. Все операции при иммобилизации гаптенов и при проведении в дальнейшем ИФА проводят при комнатной температуре.

После адсорбции белка лунки трижды промывают О,1 М натрий-фосфатным буфером (НФБ) рН 8,0, Ковалентное связывание белков с гаптеном осуществляют инкубацией в лунках в течение

4-6 ч по 0,2 мл раствора гаптена

0,05 мг/мл в 40Х.-ном растворе этило(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

1AIITEHAY (57) Изобретение относится к области медицины, преимущественно к иммунологии. Целью изобретения является упрощение способа определения антител иммуноферментным методом. Цель достигается тем, что при конъюгации гаптена с белком-носителем в качест-. ве последнего используют кроличий или яичный альбумин, который адсорбируют на поверхности твердой фазы. вого.спирта в O,l N НФБ рН 8,0, Лун1 ки трижды промывают 0,1 N натрий-фосфатном буфере + 0,1 М МаС1 + 0,05К тритона Х 100 (ТФБ) рН 7,4.

На обработанных таким образом . планшетах методом ИФА выявляют относительное число молекул гаптена, им-. мобилизованного на белке-носителе, нанесенного на поверхность твердой фазы по интенсивности окисленного субстрата, В качестве белка-носителя были испытаны ll белковых препаратов: казеинат натрия, казецит, пепсин, трипсин, бычий, кроличий, молочный и яичный альбумины, желатин, лидальбин и тестипан.

Из данных ИФА этих препаратов, проведенного с использованием кроличьей антисыворотки против конъюгата человечий сывороточный альбуминкарбофос (ЧСА-карбофос), антител против кроличьих IgG, меченных пероксидазой хрена, и 5-аминосалициловой кислоты следует, что лидальбин, бы5

Приготовление субстрата:

А) 30 мг 5-миносалициловой кислоты растворяют в 50 мл кипящей воды, охлаждают и доводят рН до 5,6-5,8;

Б) 0,2 мл 30%-ной перекиси водорода + 1,8 мл НоО;

В) из раствора Б готовят рабочий раствор перекиси водорода: 0,1 мл раствора Б + 3,3 мл НоО.

Из раствора В отбирают 1 мл и добавляют к нему 10 мл раствора А и получают раствор субстрата, Наличие в испытуемых белках антигенных детерминантов, общих с используемым для получения противогаптенных антисывороток человечьим сьвороточным альбумином, оценивалось также. методом ИФА по интенсивности окраски окисленного субстрата в лунках планшета с адсорбированным белком и не обработанным ангидридом карбофоса.

Данные ИФА показывают, что лидальбин связывает большое число молекул карбофоса. Оптическая плотность окисленного субстрата составляет 2,34 оптических единиц. Однако лидальбин дает перекрестную реакцию с антисыво-роткой против ЧСА-карбофос, оптическая плотность окисленного субстрата

2,14 оптических единиц, Таким образом, лидальбин можно использовать в качестве белка-носителя для иммобилизации гаптена; но применять в дальнейшем для ИФА не рекомендуется.

II р и м е р 2. В качестве белканосителя используют яичный альбумин.

Все приемы и операции проводят в той же последовательности, как в примере 1.

Из данных иммуноферментного анализа следует, что яичный альбумин связывает большое число молекул карбофоса. Оптическая плотность окисленного субстрата равна 1,2-1,4 оптических единиц. При определении перекрестной реакции яичного альбумина с антисывороткой оптическая плотность окисленного субстрата составляла 0,080,09 оптических единиц.

Таким образом,,яичный альбумин не дает перекрестных реакций с антисывороткой, связывает большое количество молекул карбофоса и его можно испоЛу»зовать в качестве белка-носителя для иммобилизации гаптена и для далъней-, шего проведения ИФА антител против з .148337 чий, кроличий, молочный и яичный альбумины связывают большое число молекул карбофоса. Оптическая плогность окисленного субстрата при использовании этих белков была больше двух оптических единиц, Однако из них только кроличий и яичный альбумины не дают перекрестных реакций с кроличьей антисывороткой против коныогата ЧСАкарбофос.

Антисыворотку, полученную иммунизацией кроликов конъюгатом ЧСА-гаптен в разведениях 1:100, 1:200, 1:400;

1:800; 1:1600; 1:3200, заливают в лунки планшетов с иммобилиэованным гаптеном по 0,2 мл и инкубируют 1 ч.

После инкубации лунки трижды промьвают ТФБ рН 7,4 и вносят антикроличий иммуноглобулин, меченный пероксида- 20 зой хрена (коммерческий препарат) в разведении 1:200, и инкубируют 1 ч.

Затем лунки трижды промывают ТФБ рН

7,4, заливают субстратом по 0,2 мл и инкубируют 40 мин. Пробы из лунок 25 сливают в пробирки, чтобы объем одной пробы был 2 мл и спектрофотометрируют при 450 нм на спектрофотометре СФ-26.

Пример 1. 0,4 йг лидальби- 30 на растворяют в 20 мл 0,1 M НКБ рН

9,0 заливают по 0,2 мл в лунки иммунологических полистироловых планшетов и инкубируют 4 ч. Лунки промывают

0,1 M НФБ рН 9,0, затем заливают по

0,2 мл раствора ангидрида карбофоса

0,05 мг/мл в 407.-ном растворе этилового спирта в 0,1 М НФБ рН 8,0 и выдерживают 6 ч„ Лунки трижды промьва1от

0,1 М ТФБ рН 7,4. Обработанные таким д образом иммунологические планшеты испольэ 1от в дальнейшем для проведения ИФА, Антисыворотку, полученную иммунизацией кроликов конъюгатом ЧСА-карбофос, в разведении 1:200 заливают в лунки планшетов с иммобилизованным гаптеном по 0,2 мл и инкубируют 1 ч.

После инкубации лунки трижды промывают ТФБ рН 7,4 и вносят антикроличий 5 иммуноглобулин, меченный пероксида.эой хрена в разведении 1:200, и инкубируют I ч. Затем лунки трижды промывают ТФБ рН 7,4, заливают субстратом по 0,2.мл и инкубируют 40 мин. Пробы из лунок сливают в пробирки, чтобы объем одной пробы был 2 мл, и спектрофотометрируют при 450 нм на спектрофотометре СФ-26.

Составитель П.Бонарцев

Редактор Н.Горват Техред М.Дидык Корректор А.ОбРУчаР

Заказ 2822/42

Тираж 789

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина,101

5 14 гаптенов, в частности, против карбо фоса.

Антисьворотку, полученную иммуни»зацией кроликов конъюгатом ЧСА-карбофос в разведениях 1:100, 1:200;

1:400, I:800; 1:1600; l:3200, заливают в лунки планштетов с иммобилизованным карбофосом по 0,2 мл и инкубируют 1 ч, После инкубации лунки трижды промывают ТФБ рН 7,4 и вносят антикроличий Ig меченный пероксидазой в .разведении 1:200, и инкубируют

1 ч. Затем лунки трижды промьвают

ТФБ рН 7,4, заливают субстратом по

0,2 мл и инкубируют 40 мин. Пробы из лунок сливают в пробирки объемом не менее 2 мл и спектрофотометрируют при 450 нм.

Антитела к карбофосу обнаружены в разведениях сыворотки 1:800.

Пример 3. В качестве белканосителя используют кроличий альбумин. Все приемы и операции проводят. в той же последовательности, как в примере 2.

Из данных иммуноферментного анализа следует, что кроличий альбумин не дает перекрестных реакций с антисывороткой, связывает большое число молекул карбофоса. Оптическая плотность окисленного субстрата составляет 2,56 оптических единиц. Таким образом, кроличий альбумин можно использовать в качестве белка-носителя для определения антител против гаптенов в ИФА.

83375 6

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом расширяет круг лабораторий, использующих методы иммуноферментного анализа в своей практичес5 кой деятельйости..В; качестве носителя в иммунохимических методах анализа могут быть использовань1 белки, не образующие растворимые конъюгаты с гаптеном, а также белки, которые .при исчерпьвающей иммобилизации на них гаптена, выпадают в осадок. Значительно снижается трудоемкость выявления белков-носителей для иммунохимического метода, так как отпадает необходимость в отработке условий . синтеза конъюгата для каждого испытуемого белка и анализируемого гаптена. Анализ 11 белковых препаратов на

2р пригодность в качестве белка-носителя в ИФА занимает 11-12 ч. Упрощается способ определения антител против гаптенов методом ИФА.

Формула изобретения

Способ определения антител к гаптенам, включающий конъюгацию гаптена с белком-носителем, адсорбцию конъюгата на поверхности твердой фазы, соединение с исследуемыми антителами

З0 и выявление присоединившихся антител методом иммуноферментного анализа (ИФА), отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве белка-носителя используют кро35 личий RBH H HblA ельбумину при этом его адсорбируют на поверхность твердой фазы и конъюгируют с гаптеном.