Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus - продуцент моноклональных антител к лимфоидным лейкозам т- клеточного ряда и т-лимфоцитам человека

 

Изобретение относится к био технологии и может быть использовано при иммунологической диагностике острого и хронического лимфоидного лейкоза и изучении иммунологического статуса пюдей. Цель изобретения получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (МАТ) к поверхностному антигену, присутствующему как На зрелых Т-лимфоцитах и тимоцитах здоровых лиц, лейкозных клетках больных острым лимфобластным лейкозом Т-тила, хроническими лимфолейкозами Т- и В-типов и Т-лимфом, так и на бластных клетках больных острым лимфобллстным лейкозом пре-Т-типа. Штамм дес понирован под номером ВСКК (П) №1290, Штамм продуцирует МАТ класса lg G I ,к Т-лимфоцитам человека и лимфоидным лейкозам Т-клеточного ряда в титре 1:10. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

С 12 М 5/00//А 61 К 39/395

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (46) 30. 12. 90. Бюл. 1I 48, (21) 4311450/28-13 (222 30.09.87 (71) Центральный научно-исследователь" ский институт гематологии и переливания крови (72) Н.Н.Новикова, Г.Ю.Митерев, М.С.Новикова, С.В.Данилевич и Т.И.Булычева (53) 578.085.23(088.8) (56) Патент США У 4363799, кл. А 61 К 39/395, 1984 °

Engelman E.G. et а1. In J. Proc, Nat. Асад. Sci, (USA), ч. 78, 1981, p,1791. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К Л1МФОИДНЬМ ЛЕЙКОЗАМ Т-КЛЕТОЧНОГО РЯЦЛ И

Т-ЛИМФОЦИТАМ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биоI

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при иммунологической диагностике острого и хронического лимфоидного лейкоза и,изучении иммунологического статуса людей .

Цель изобретения — получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к поверхностному антигену, присутствующему как на зрелых Т-лимфоцитах и тимоцитах здоровых лиц, лейкозных клетках больных острым лимфобластным лейкозом Т. типа, хроническими лифолейкозами Ти В-типов и Т-лимфом, так и на бласт2

° технологии и может быть использовано при иммунологической диагностике острого и хронического лимфоидного лейкоза и изучении иммунологнческо го статуса людей. Цель изобретения . получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (МАТ) к поверхностному антигену, присутствующему как на зрелых Т-лимфоцитах и тичоцитах здоровых лиц, лейкозных клетках больных острым лимфобластным лейкозом Т-типа, хроническими лимфолейкозами. Т- и В-типов и Т-лимфом, так и на бластных клетках больных острым лимфобластным лейкозом пре-T-типа. Штамм депонирован под номером ВСКК (П) 11 129 D

Штамм продуцирует MAT класса Ig G I к Т-лимфоцитам человека и лимфоид.ным лейкоэам T-клеточного ряда в титре. 1:10. 2 табл. ных клетках больных острым лимфобластным лейкоэом пре-Т-типа. С 4

Штамм гибридных культивируемых . © клеток животных Mus musculus BCA-16 (1F12) получен путем слияния клеток мышиной миеломы Р3-Х63-Ag8,553 с клетками селезенки мышей ВА1В/с, иммунизированных лейкозными клетками больной хроническим лимфолейкоэом

Т-типа. Сшивающий агент - полиэтилен- 4. гликоль. Система селекции гибридных клеток — 3 клонирования, Штамм депонирован в банке клеточных культур Института цитологии АН

СССР под регистрационным номером

148394Ü

ВСКК(П) У 129 П и характеризуется следующими признаками, Культуральные свойства.

Средой для культивирования кле5 ток является RPNI-1640 или РМЕМ с

20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2X L-глутамина, 1Х пирувата натрия, 0,1% гентамицина и 107 кондиционной среды, Характер роста — стандартная 10 суспензия. Метод снятия - встряхивание,- Частота пассирования 2-3 суток, Кратность рассева 1:20. Титр антител в культуральной жидкости 1 10.

Культивирование в организме животного.

Развитие асцитной формы у мышей

BAlB/с происходит на 8"30 сутки, Титр антител в асцитной жидкости со ставляет 1:200, 20

Продуктивность штамма.

Титр антител в культуральной среде 1:10 (в реакции непрямой иммунофлюоресценции).

Характеристика полученного про- 25 дукта. Штамм продуцирует моноклональные антитела (MAT) класса Ig GI к Т". лимфоцитам человека и лимфоидным лейкозам Т-клеточного, ряда.

Консервация клеток, 30

Клетки штамма ВСА-lб (1F12) "заморожены после первого и второго клонирований, а также на каждом пассаже в культуре и после роста в виде асцитной опухоли мыши. Криоэащитная среда — 40% ростовой среды (или RPMI1640), 50% эмбриональной телячьей. сыворотки и 10% диметилоульфоксида.

Режим.замораживания: клетки в криозащитной среде переносят в пластико- 10 вые пробирки на 1 мл с крьппкой и помещают на 1 сутки (18-24 ч) и холодильную установку при -70oC после чего переносят в жидкий азот, Оттаивание производят при Э? С в течение

1,5 мин..Жизнеспособность клеток при размораживании составляет ?090%.

Сведения о контаминантах ликии.

Бактерии, грибы, дрожжй и микоплазма не обнаружены.

П р и и е р 1, Исследование специфичности. Специфичность NKA в культуральной жидкости клеток гибридного штамма ВСА-16 (1F12) и асцитной жидкости к антигеиам мембран различ" ных типок клеток определяют в микро" луночкой модификации реакции непрямой иммунофлюоресценции. На первом этапе реакции.1-2 х 10 живых клеток,, прикрепленных к микролунке стекл» или находящихся в микролунке микро- . титраторной пластины, соединяют с

20-30 мкл культуральной жидкости или асцита в разведении 1:1.0 " 1:200 и инкубируют 30 мин.при 0 С с последующим днухкратным отмыванием. На втором этапе клетки соединяют с 20-.

30 мкл ФИТЦ-меченых козьих антител к

Ig мыши. После 30 мин инкубации клетки дважды отмывают и результаты реакции оценивают с помощью флюоресцентного--микроскопа или проточного цитофлюориметра. Реактивность ИКА

ВСА-16 (1F12) с различными клетками патологического и нормального лимфои миелопоэза представлена в табл.1 и 2. По результатам тестирования полученные МКА выявляют антиген, содержащийся на лейкозных клетках острых лимфобластных лейкоэов пре-Т- и Т-типов, хронических лимфолейкозов Т- и ь

В-типов и Т-лимфом, а также на нор мальных Т-лимфоцитах, тимоцитах и отсутствующий на клетках миелоидных лейкозов, зрелых моноцитах, нейтрофилах и В-клеточных линиях. Обнаружено, что NKA, продуцируемыв штаммой

ВСА-16 (1F12), обладают вариабельной комплемент - зависимой активностью по отношению к указанным выше антигенсодержащим клеткам"мишеням. !

Ф

Пример 2. Определения класса иммуноглобулинов s полученных ИКА

ВСА-16 (1F12)

Класс и субкласс к муноГлобулинов мыши в полученных МКА определяют в иммуносорбентном методе энзиммеченых антител (ELISA) с использованием кро личьих антител против классов и субклассов иммуноглобулинов мышей и пероксидазмеченых козьих антител против иммуноглобулинов кроликов. Выявлено,. что штамм гибридных клеток ВСА-16 (1F12) секретирует мышиные МКА- класса Ig GI

Таким образом, использование ново-: го штамма мышиных гибридных клеток

ВСА-16 (1Р12), продуцирующего МКА к поверхностному антигену, присутствующему на клетках, больных острьики лимфобластными лейкозами пре-Т и Т-типов, хроническими лимфолейкоэами Ти В-типов и Т-лии3омами, а также на нормальных Т-лим@оцитах и тимоцитах

Таблица

Реактивность МКА ВСА-16 (lP12) к различным клеткам патологического лимфо- и миеолопоээа

Лейкозные клетки больных Реактивность ИКА

О/У"

2/5 2/2

12/17

2/4

1/2

5/6

О/15

П риме ч а ние: "- реакция считается положительной при наличии свыше

25Х ВСА-поло-. жительных ! клеток;

" " в числителечисло положительных случаев, в знаменателе - общее число обследо» ванных больHbm °

5 148394 и отсутствующему на клетках миелоидных лейкоэов, зрелых моноцитах, нейтрофилах и В-клеточных линиях, позволяет повысить информативность в иммунологической диагностике различных форм гемобластозов.

Острыми лимфобластными лейкозами: пре-В-типа пре-Т"типа

Т-типа

Хроническими лимфолейкоэеми:

В-типа

Т-супрессорного типа

Лимфомами:

В-тийа

Т-хелперного типа

Острыми миелобластными лейкозами

6 6

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П)

В 129D — продуцент моноклональных антител к лимфондным лейкозам Т-клеточного ряда и Т-лимфоцитам человека, 1483946

Таблица 2

Реактивность МКА ВСА-16 (IFI2) к различным клеткам нормального лиМфо и миелопоэза

Клетки крови и клеточных линий

69,017,8

0

П р и м е ч а н и е: +- собственные данные, попу ченные при обследовании 10

° -доноров крови.

Составитель Г.Смирнова

Редактор Л.Павлова Техред А.Кравчук КорректорТ.Колб б

Заказ 4328 Тираж 498 ., Подписное

ВЯИИПИ Государственного комитета о изобретениям и открытийм при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Ьь

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óàãîðîä, yst. Гагарина,101

Лимфоциты крови

Моноциты крови

Нейтрофилы крови

Тимоциты

ФГА-активированные лимфоциты крови

Клетки В-клеточных

ЛИНИЙФ

Dandi;

Ra) i .Клетки миелоидиой линии К-562

Содержание ВСА-16 (1F12) - положительных клеток в . популяции, Z (М+м)

ФЮ

70,6+5,6"

7,612,3

66,5 6,3