Способ получения рибои дезоксирибонуклеозид-5 @ - трифосфатов

 

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано в биохимической промышленности для производства рибои дезоксирибонуклеозид-5<SP POS="POST">1</SP>-трифосфатов. Цель изобретения - упрощение способа и повышение выхода целевых продуктов. Исходную биомассу E.COLI разрушают, полученную клеточную суспензию обрабатывают калийфосфатным буферным раствором рН 7,5, содержащим декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) в концентрациях 1,0-1,5 и 5-10 мас.% соответственно. Смесь центрифугируют, супернатант, содержащий ПЭГ, иммобилизуют на аминопропилсилохроме или аминоэтилцеллюлозе и используют для фосфорилирования соответствующих нуклеозид-5<SP POS="POST">1</SP>-монофосфатов с добавлением в реакционную смесь ионов MG<SP POS="POST">2+</SP>, ацетилфосфата, АТФ или дАТФ в случае синтеза дАТФ и калийфосфатного буфера рН 7,5. Выход всех рибои дезоксирибонуклеозид-5<SP POS="POST">1</SP>-трифосфатов составляет 95-98%. Способ прост в технологическом отношении и может без дальнейшей доработки использоваться в промышленности. 2 з.п.ф-лы, 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

COLIHAËÈÑÒÈ×ÅÑHÈÕ

РЕСПУБЛИК AInl) f h )JI в;

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4310581/28-13 (22) 08.07.87 (46) 15.07.89. Бюл. 11- 26 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) В.П.Гурьев, Т.Л.Гурьева, С.А.Дегтева и В.Ф.Подгорный (53) 663.!5(088.8) (56) Canellakis Е.S., Gottesman M.Е., Kammen Н.О. — Biochem. Biophys.

Acta., 1960, ч.39, р.82-87.

Авторское свидетельство СССР

У 125509, кл. С 07 Н 19/10, 19/20, 1985. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБО- И ДЕЭОК

СИРИБОНУКЛЕОЭИД-5 -ТРИФОСФАТОВ (57) Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано в биохимической промышленности для производства рибо- и деэоксирибонуклеозид-5 -трифосфатов. Цель—

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано в биохимической промышленности для производства рибо- и дезоксирибонуклеоэид-5 -трифосфатов.

Г

Цель изобретения — упрощение способа и повышение выхода целевых продуктов.

Сущность способа заключается в следующем. Синтез нуклеоэид-5 -три/ фосфатов проводят из соответствующих нуклеоэид-5 -монофосфатов в присутствии ионов Mg, АТФ, ацетилфосфата, калийфосфатного буфера рН 7,5-7,8 с попощью иммобилиэованного на активи„„SU„„1493644 А1 (51)4 С 07 H 19/)О, "„12 Н 11/06 изобретения — упрощение способа и noВ вышение выхода целевых продуктов. Исходную биомассу Е.coli разрушают, полученную клеточную суспензию обрабатывают калийфосфатным буферным раствором рН 7,5, содержащим декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) в концентрациях 1,0-1,5 и 5-10 мас.7 соответственно. Смесь центрифугируют, супернатант, содержащий ПЭГ, иммобилизуют на аминопропилсилохроме или аминоэтнлцеллюлоэе и исдольэуют для фосфорилированин соответствующих нуклеозид5 -монофосфатов с добавлением в реакI ционную смесь ионов Mg т, ацетилфосфата, АТФ или дАТФ в случае синтеза С дАТФ и калийфосфатного буфера рН 7,5.

Я

Выход всех рибо- и дезоксирибонуклеоэид-5 -трифосфатов составляет 95-984 °

Способ прост в технологическом отно- С шении и может беэ дальМейшей доработки использоваться в промышленности.

2 э.п.ф — лы, 3 табл. М О рованных глутаровым альдегидом ами- 1 ноэтилцеллюлоэе или аминпропилсило- Ж хроме комплексного ферментного пре- 0Р парата, нуклеотидилкинаэ и ацетоки- ДЪ назы, взятого в соотношении с исходным нуклеозид-5 --монофосфатами I:(10—

20) и полученного по следующей схеме: разрушение исходной биомассы F..coli (Е.coli MRE-600 или E.coli В, инфицированной фагом Т4 аш Ф 82) лиэоцимом и ультразвуком; обработка полученной клеточной суспензии калийфосфатным буферным раствором рН 7,7-7,8, содержащим дек3 149364 стран, полиэтиленгликоль (ПЭГ),в концентрациях 1,0-1 5 и 5-10 мас.7. соответственно °

Полученный после центрифуг ирова5 ния смеси супернатант, содержащий

ПЭГ, используют в качестве комплексного ферментного препарата, содержащего ацетокинаэу и оптимальггый набор нуклеотидилкиназ, позволяющий получать рибо- и деэоксирибонуклеозид-5—

I трифосфаты с высоким выходом, аименно выход в синтезе всех НФТ составля- ет 95-987. или 350-400 r/êã биомассы.

Пример 1. Операции по очи- !5 стке комплексного ферментного препарата нуклеотидилкинаэ проводят при

0-4 С.

100 г замороженных клеток Е.coli

MRE-600 суспендируют в 300 мл 0,1 M 20 калийфосфатного буфера рН 7,8. В суспензию добавляют 200 мг лизоцима, предварительно растворенного в 40 мл буфера, выдерживают в течение 45 мин при постоянном перемешивании. После этого суспензию озвучивают в ледяной бане на ультразвуковом дезинтеграторе (18 кГц) в три сеанса по 1 мин с минутными перерывами. Затем в полученную клеточную суспензию добавляют 30

0,1 М калийфосфатный буфер рН 7,8, содержащий 207.-ггый раствор декстрана (м.в. 500000) и 407о-Hûé раствор ПЭГ (м.в. 6000), до конечных концентраций

1,2 и 7,07 соответственно. Сггесь пе- 35 ремешивают в течение 20 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин.

Верхнюю фазу, содержащую ПЭГ, сливают и используют как комплексный ферментный препарат. Ферментный препарат им- 40 мобил. зуют на аминопропилсилохроме, активи ованном глутаровым альдегидом.

Для активации 100 г (вл.мас.) АПС используют реакционную смесь следующего ссстава: 90 мл 257.-ного глутаро- 45 вого альдегида, 540 мл 1 М калийфосфатного буфера рН 7,8. Реакцию активации проводят в течение 3 ч при ком, натной температуре при перемешивании реакционной смеси вращением колбы.

По окончании реакции сорбент отмывают от глутарового альдегида водой.

Иммобилиэацию проводят при нагрузке по белку на матрицу 50 мг/г вл,мас.

H концентрации белка в реакционной смеси 5 мг/мл в 0,1 M калийфосфатном буфере рН 7,8 при комнатной температуре в течение 3 ч при перемешивании реакционной смеси вращением колбы.

4 4

Затем иммобилизованный ферментный препарат обрабатывают при перемешивании двойным объемом 0,27.-ного раствора боргидрида натрия в течение

1 ч при 2-4 С. После этого ИФП промывают 0,5 М раствором хлористого калия в 0,5 M калийфосфатном буфере рН 7,5, затем 0,05 M калийфосфатным буфером рН 7,5. Количество иммобилизованного белка в 1 г готового ИФП

25 мг.

Реакционную смесь, содержащую в

1 л 0,05 M калийфосфатного буфера (рН 7,5)5 r гуанозин-монофосфата (ГМФ), 18,4! r ацетилфосфата, 16,24 r

М С1, 1,10 г АТФ, 150 мкм р-меркаптоэтанола, 100 r ИФП, инкубируют при

37 С при перемешивании вращением колбы. Полноту синтеза ГТФ определяют ионообменной хроматографией на микроколонке с анионообменником Дауэкс

1х2. Выход .ГТФ в синтезе составляет

987.

Целевой продукт ГТФ из реакционной смеси вьщеляют известным способом.

Для этого реакционную смесь с целью разделения ее компонентов хроматографируют на колонке объемом 1 л, заполненной анионообменником АВ 17х?. Элюцию проводят линейным градиентом хлористого натрия (0-0,5 М) в 3 мМ НС1.

Элюат ГТФ собирают фракциями по 0,5л, нейтрализуют до рН 7,0, затем концентрируют упариванием при 37 С до концентрации соли в нем 1 5 M. Продукт выделяют осаждением из сконцентрированного элюата предварительно охлаж; денной до — 15-20 С смесью 2М НС1

967.-ный этиловый спирт при соотношении концентрат ГТФ-2М НС1 — этиловый спирт = 1:1/10:10 приливая вначале при перемешивании раствор кислоты, затем этиловый спирт. Для формирования осадка ГТФ смесь выдерживают при

-15-20 С в течение 1 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 3 тыс.об/

/мин в течение 15 мин при 2-4 С, Затем аналогичным образом проводят очистку ГТФ переосаждением, при этом осадок ГТФ предварительно растворяют в воде. Полученный осадок ГТФ промьгвают этанолом и лиофильно сушат. Выход готового продукта составляет

4,6 r.

Препарат идентифицируют методом тонкослойной хроматографии, используя пластины силуфола или кизельгеля

60 F 254 в системе диоксан-иэопропи1493644

Пример 10. Ферментный препарат выделяют иэ 200 r клеток Е.coli

MRE-600 аналогично примеру l. Ферментный препарат иммобилиэуют на ами5 нопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом. В реакционную смесь, содержащую 5 г уридинмонофосфата, загружают 180 г ИФП. Выход УТФ составляет 967. 1О

Пример ll. Ферментный препарат выделяют иэ 50 г клеток Е.coli В, инфицированных фагом Т4 ат 11- 82, и иммобилиэуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом, 15 аналогично примеру l.

В реакционную смесь, содержащую

5 г аденозинмонофосфата, загружают

50 r ИФП. Выход АТФ в синтезе составляет 987., выход готового продукта 20

6,0 г.

Выходы АТФ в синтезе и выходы готовых препаратов АТФ при дальнейшем использовании указанного ИФП приведены в табл.2. 25

Пример 12. Ферментный препарат выделяют из 50 r клеток Е.coli В, инфицированных ((arov Т4 am

М 82, аналогично примеру 1, за исключением того, что испольэу:эт 0,1 M натрийборатный буфер рН 7,8. Ферментный препарат иммобилиэуют на АПС аналогично примеру 1, за исключением того, что на стадии иммобилизации используют 0,1 М натрийборатный буфер рН 7,8.

В реакционную смесь, содержащую

5 г дезокситимидинмонофосфата, загружают 60 r ИФП. Выход дТТФ в синтезе составл:-тот 97Х, выход готового пре- 40 парата; ТТФ 5,3 r.

Пример 13. Ферментный препарат вьщеляют иэ 50 r клеток Е.coli

MRE-600 аналогично примеру 1. Ферментньп препарат иммобилиэуют на аль4 дегидоси.чохроме, полученном модификацией силохрома с помощью (3,3-диэтоксипропил) триэтоксисилана, в лабораторных условиях НИКТИ БАВ.

Иммобилиэацию проводят при на" груэке по белку на матрицу 50 мг/г вл.мас. и концентрации белка в реакционной смеси 5 мг/мл в 0,1 М калийфосфатном буфере рН 7,8 при комнатной температуре в течение 3 ч при перемешивании реакционной смеси враще55 нием колбы. Дальнейшую обработку иммобилизованного фермента препарата проводят аналогично примеру 1. Количество иммобилизованного белка в 1 г готового ИФП 30 мг.

В реакционную смесь, содержащую

5 r деэоксицитидинмонофодфата, загружают 55 г ИФП. Выход дЦТФ в синтезе составляет 987, выход готового препарата 3,0 r.

Пример 14. Ферментный препарат выделяют иэ 50 г клеток Е.coli

MRE-600, инфицированных фагом Т4 am

Р 82, аналогично примеру 1. Затем ферментный препарат иммобилиэуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую

5 г деэоксигуанозинмонофосфата, загружают 50 r ИФП. Выход д."ТФ s син "е эе составляет 967., выход целевого продукта 4,6 r °

Условия получения НТФ и выход продуктов приведены в "абл.3.

Формула изооретения

Ь

1. Способ получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфатов,. ( включающий разрушение клеток биомассы Es"herichia coIi В или Е.coli

MRE-600, инфицированнь.х фагом Т4 аш

11(82, выделение из полученной клеточной суспенэии комплексного ферментного препарата, содержащего нуклеотидилк((((азу и ацетокиназу, иммобилизацию последнего на активированной матрице и последующее фосфорилирование соответствующих рибо- и дезоксирибонуклеоэид-5 -монофосфатов с помощью полученного иммобилизованного ферментногo препарата с добавлением в

z+ реакционную смесь ионов Mg ацетилфосфата, АТФ или дАТФ в случае синтеза дАТФ и фосфатного буфера, о т— личающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевых продуктов, комплексный ферментный препарат выделяют путем оЯработки клеточной суспензии буферным раствором, содержащим декстран, полизтиленгликоль в концентрациях

1,0-1,5 и 5 — 10 мас.Е соответственно, а. фосфорилирование соответствующих нуклеоэид-5 -монофосфатов иммобилиlзованным комплексным ферментным препаратом проводят при соотношении 1: (10-20) соответственно.

2. Способ по п.l, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве буферного раствора используют калийфосфат5 14936 ловый спирт — 5M аммиак — 1 М ацетат аммония — 30:18:49:3, Содержание УФпоглощающих примесей в препарате 2Х, содержание основного вещества 99Х.

Пример 2. Ферментный препарат вьщеляют иэ 50 г клеток Е.cali В, инфицированных фагом Т4 am 11 82, аналогично примеру 1, эа исключением то"

ro, что используют декстран и ПЭГ в концентрациях I и 5Х соответственно °

Ферментный препарат иммобилиэуют MR аминоэтилцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом, аналогично примеру 1, за исключением того, что иммобилизацию проводят при 2-4 С в течение 14 ч.

Хроматографию и выделение дТТФ проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что для люации ком- 20 понентов реакционной смеси используют хлористый литий, а осаждение продукта проводят cÿåcüþ метанол-ацетон при соотношении концентрат дТТФ вЂ” метанол — ацетон = 1:1:10, приливая 25 вначале при перемешивании метанол, затем ацетон.

Препарат идентифицируют тонкослойной хроматографией, используя пластины силу ..ола или кизельгеля 60 F 254 30 в системе диоксан — изопропиловый спирт — 2M аммиак — IМ .ацетат аммония = 30:20:47:3. Содержание УФ-поглощающих примесей в препарате 2Х, содержание основного вещества 97Х.

Условия препаративного выделения продуктов НТФ, их иденти .икация, степень чистоты гредставлены в табл.1.

Пример 3. Ферментный препа- 40 рат выделяют из 50 г клеток Е.coli В, инфицированных фагом Т4 am У 82, аналогично примеру 1, за исключением того что используют декстран, ПЭГ в концентрациях 1 и 5Х соответственно, 45 ферментный препарат иммобилизуют на аминоэтнлцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую

5 r дезокситимидинмонофосфата, загру- 50 тают 60 r ИФП. Выход дТТФ составляет

96Х.

Пример 4. Ферментный препарат вьщеляют иэ 50 г клеток Е.coli

MRE-600 аналогично примеру 1, эа исключением того, что используют декстрак и ПЭГ в концентрациях 1,5 и IOX соответственно. Ферментный препарат иммобилиэуют на аминопропилсилохроме, 44 активированном глутаровым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую 5 г деэоксицитйдинмонофосфата, загружают

65 г ИФП. Выход дЦТФ ссс гавляет 97Х.

Пример 5. Фар;:ентный препарат выделяют иэ IдО r клеток Е.coli

MRE-600 аналогично примеру 2, за исключением того, что использу:от декстран и ПЭГ в концентрациях 2 и 12Х со" ответственно. Ферментный препарат иммобилизуют на ам)почт :лцеллилозе, активированной глу а, овым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую 5 r уридинмонофосфата, загружают 90 г

ИФП. Выход УТФ составляет 89Х.

Пример 6. Ферментный препарат вьщеляют иэ 100 г клеток F..coli

MRE-600 аналогично примеру I эа йсключением того, что используют декстер ран и ПЭГ в концентрациях 1,4 и 9Х соответственно. Ферментный препарат иммобилиэуют на аминоэтилцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом, В реакционную смесь, содержащую 5 г уридинмонофосфата, загружают 100 г

ИФП. Выход УТФ составляет 98Х.

Пример 7. Ферментный препарат выделяют иэ 50 г клеток E.coli В, инфицированных фагом Т4 ат У 82, аналогично примеру 1, эа исключением того, что используют декстран и ПЭГ в концентрациях 0,8 и 4Х соответственно.

Ферментный препарат иммобилиэуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом. В реакционную смесь, содержащую 5 r дезоксиаденозинмонофосфата> 0,81 r дАТФ, загружают 60 r ИФП. Выход дАТФ составляет

92Х.

Пример 8 ° Ферментный препарат выделяют иэ 30 r клеток Е.coli

MRE-600 аналогично примеру 1. Ферментный препарат иммобилиэуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую

5 r цитидинмонофосфата, загружают

30 г ИФП. Выход ЦТФ составляет 65Х.

Пример 9. Ферментный препарат вьщеляют иэ 30 r клеток Е.coli В, инфицированных фагом Т4 аш 11 82, аналогично примеру 1, иммобилизуют

КФП на аминоэтилцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую

5 г деэоксигуанозинмонофосфата, загружают 25 r ИФП. Выход дГТФ составляет 85Х.

9 1493644 10 ный или натрийборатный буфер рН 7,5- вированной матрицы используют ами7,8. нопропилсилохром или аминоэфилцеллюСпособ по п ° 1, о т л и ч а ю — лозу, активированные глутаровым аль" тем, что в качестве акти- дегидом.

Т ° блиц ° 1

Стаиака ккстоти

Хронатограбвгеаскаа оакорокиоств, одариаииа осос аида

BoanhI

Ьагаие са1и

"Са1Ь|о- "SI Sea"

hag"" иовкого авеста, 2

2N ВС1-этакол

Натаиол" ацатои

2N НС1-эти

2N BC 1-этаиол

2N BCl этаиол

Иатаиои аистов

2N НС1-этаиол

2И НСl-этаиол

9S

96

97

97

99

96

9 -Г00 S

95-96

Ь2

Г

1 Систаеа ls диоксаи - иаоиромловва сиирт - SN еоо ак IN акотат вееокик 30: IS:а9:3

Cgctaea 2: диоксаи - кэоироакловай слирт - 2N weax IN agatat амвиик 30i20:37 3

Даивю вэатм иэ каталогов ткаэамеос Ьирк оa

Таблица 2

Кратность использо»вания ИФП

Выход продукта готового

В синтезе

7 препарата, r

Т а б л и ц а 3

Выход продукта

Соотноше ние субстратИФП

Концентрации

ПЭГ; декстрана, Х

Продукт

Пример в син- целевого тезе, Х продукта, r

1,2; 7,0

2; 12 .1,4; 9,0

1 ГТФ

2 дТТФ

3 дЦТФ

4 УТФ

5 УТФ

6 дАТФ

7 ЦТФ

8 дТТФ

9 УТФ

l0 дГТФ. дАТФ дТТЭ дГТФ дНТФ

АТЬ

ШФ

BaC)

ИС1

НаС1

BaCl

Нас1

LiC1.

ВаС1

ВС1

3

5

7

9

97

97

97

92

9S.

99

99

97

98

97

96

96

97,5

96

97,5

97

96

9Ь,5

96

1:20

1:12

1:13

1:18

1:20

1:12

1:6

1:5

1:36

1:10

94

ЬО

Ь3

63 35

6,2

6,15

6,05

6,1

6,05

6,0

6,0

6,0

5,95

98

96

97

89

98

92

96

4,6

5,3

3,0

4,8

5,3

5,2

2,6

4,0

5,3

4,6

9S

Ь 5-90

91

93