Способ выявления вторичных мутагенов

 

Изобрететте относится к медицине и может быть использовяно для выявления BTOptniHbrx мутагенов. ЦеЛь изобретения - повышение чувствительности способа. Цель достигается за счет использования микросом печени белых крыс, содержащихся на диете с дефицитом лизина, треонина, метионина и витаминов А, Е и С. Способ может быть использован в экспериментальной онкологии, нутрициологии, гигиене окружающей среды и токсикологии. 6 таол.

СООЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РНХМЬЛИН

А1

„.Я0„„151

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A BTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПЮ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ fHHT СССР (46) 30. 04. 91 . Бюл. Ф 6 (21) 4255262/ !4 (22) 01.06.87 .(71) Казахский филиал Института питания АМН СССР (72) Т.Ш. Шарманов, Ш.С. Тажибаев, Т.Ж. Нурмагамбетов, Ш.A. Баканов, Т.К, Куакышгва, Б.Б. Амиров и Л.И, Каламкарова (53) 612.015(088.8) (56) Nutet Res., 1975, v. 31, р.347. ! (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ

МУТАГЕ НОВ

Изобретение относится к области медицины, а именно к биологическим методам оценки генетической опасности факторов .окружающей среды, и предназначено для повьпиения чувствительности индикаторной тест-системы. рля де цактирования вторичных мутагенов, нуждающихся в метаболической активации, и может быть использовано в экспериментальной онкологии, нутрициологии, гигиене окружающей среды и токсикологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Используют растущих крыс-самцов линии ВАГ с исходной массой тела 5060 r. Экспериментальных животных со« держат-на диете, в которой аминокислотный дисбаланс достигался путем sa" .мены 83Х казеина на пшеничную клейковину, которая бедна по содержанию лизйна, треонина и метионина„ а ви(5!)5 С 12 g 3/00/ /С 01 N 33/48 (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления вторичных мутагенов. Цель изобретения — повышение чувствительности способа. Цель достигается

sa счет использования микросом печени белых крыс, содержащихся на диете с дефицитом лизина, треоккна, метиокика и витаминов А, E и С. Способ может быть использован в эксгеримекталькой онкологии, нутрициологии, гигиене окружающей среды и токсикологии. 6 табл. тамиккую недостаточность моделируют исключением из состава диеты витаминов A,Ñ и E. Контрольные группы животных содержат на общевиварком рационе и сбалансированном полусинтетнческом рационе.

Перед забоем, после содержания на Ю вышеуказанных рационах в течение 1,52 месяцев, эа 24 ч имвотных лишают ),"ф корма. В качестве фермекткых сис- фф тем для метаболической активации вто- ф",) ричных мутагенов используют микросо- ©) мы печени. Экспериментально установлено, что оптимальная концентрация микросомального белка в инкубационной смеси 1,5-3,0 мг/мл. В экспериментах испольэовали концентрацию белка в инкубационной смеси 2,0 мг/мл.

Подготовка бактериальной культуры. Культуру (За1щопе11а typhiinurium

ТА )535) с косяка переносят петлей в .

10мпмясо пептонного бульона и подращивают в термостате при 37 С н течение 18 ч. В день постановки экс3 " 1510366 4 перимента 5 О мл ночной культуры пе- Число ревертантов определяют пу» реносят в 100 мп мясо-пептонного буль- тем перемножения среднего числа ко" она и подращивают при 37 С до плот- лоний на чашках на четыре и получают ности 5. 10 клеток при постоянном 5 число мутантов a I мл. Расчет частовстряхивании. Содержимое колбы пе- ты мутаций производят путем деления реносят в стерильные центрифужные числа мутантов в 1 мл число выживших пробирки и цеитрифугируют на центри- клеток. Статистическую обработку фуге,K-23 при 4 С при 5000 об/мин . полученных данных проводят по критев течение 20 мии. Осадок суспенди- 10 рию Стьюдента. руют в 30 мл минимальной среды, раз- 11 р и м е р 1. Эксперимент проведенной в четыре раза. Центрифуги- водят на трех, группах крыс линии рование повторяют и том же режиме, ВАГ. Первую группу крыс содержат

Осадок ресуспеидируют в 15 мл 0,15 N на общевиварном рационе. Вторая групхлористого кааия. 15 па животных получает сбалансированВ инкубационную смесь, содержа- . ную полусинтетическую диету (табл.l).

М ую 0,7 мл бактериальной суспензия, Третью группу животных содержат на

0,1 раствора хлористого магния (160 vN) диете с дефицитом лизина, треонина, 0,2 мл 0,5 ьИ раствора НАДФН, 0,3 мл метионина и витаминов А, С и Е суспензни микросом добавляют в слу- 20 (табл.2). чае контрольных вариантов 0,2 мл Состав солевой смеси полусинтетидистиллированиой воды, а в опытные ческих диет приведен в табл. 3. Соо варианты либо 0,2 мл И-нитрозомор- тав витаминов - в табл. 4. В диету яси-I фолина до конечной концентрации вотных третьей группы витамины А С

200 мкг/мп, либо 0,2 мл циклофосфа- 25 и Е не вводят. на до конечной концентрации 500 мкг/мл. Иивотных содержат на вышеуказанных

Инкубационную смесь выдерживают на рационах в течение l,5-2 месяцев. В водяной бане при 37 С в течение 30 мин течение трех дней перед забоем все йри постоянном встряхивании. Реак- группы экспериментальных животных поцию останавливают добавлением 2,0 мл 30 лучают внутрибрюшинно. инъекции фехолодного 0,15 N раствора хлористого нобарбитала в дозе 80 мг/кг массы калия. Затем инкубационную смесь цент- тела. Выделение препарата микросом рнфугируют прн 5000.. об/мин в тече- печенн крыс проводят общепринятым ние 10 мин. Осадок суспеидируют и методом.

1,5 мл минимальной жидкой среды, раз- 35 Данные по мутагенной метаболичеведенйЬй в четыре раза. ской активации Н-нитрозоморфолина и

Для определения количества выжив- . циклофосфана, при описанных выше зксших бактерий 0,5 мл суспензия разно- периментальных условиях, приведены дят до 10 и 0,5 мл разведенной сус" в табл. 5 и 6 соответственно. пензии вносят в чашки с мясо-пептон- 40 Как видно из табл.5. частота инным агаром и подращивают в термостате дуцироваиных мутаций вследствие мепри 37. С в течение 18 ч. таболической активации И-нитрозоморДля учета количества ревертантов фолина выше при использовании био0,25 мл цельной суспензии переносят в материала животных, содержащихся на пробирки с 0,6Х-ным минимальным ага- 45 диете с дефицитом лизина, треонина Ф ром (предварительно расплавленным при метионина и витаминов A,С и Е, по

l00 C), перемешивают. Содержимое сравнению с другими группами животпробирки разливают на чашки. Петри с ных. Так, количество индуцироваиных

1,5g-ным минимальным агаром и инкуби- мутаций с биоматерналомтретьей группы руют в термостате прн 37 С в течение 50 животных увеличивается в 1,5-6 раз «Д8 ч., по .сравнению с остальными группами.

Для учета выживших бактерий под- Такая же направленность возрастасчитывают количество колоний на чаш- иия частоты индуцированных мутаций ках, среднее умножают на два и опре" набюдалась при использовании в каче,деляют число жизнеспособных клеток 55 стве тестируемого вторичного.мутагена в 1 мй при данном разведении. Путем . циклофосфана (табл.6). Как видно из, перемножения этой величины на козф- таблицы,.количество мутаций при ис"

1 фициент разведения получают wcno mrna- пользовании биоматериала животных неспособных, клеток в исходном варианте третьей группы достоверно увеличио

10366

У

Таблица 1

Состав (r/)00 г) и калорийность сбалансированной полусинтетической диеты

Содержание, г

Количество

Продукты

Калорийность белки жиры углеводы

62,22

186,16

14,62 0,25

0,5

45,04

69,84

29,28

21 73

7, 50

0,67

2,53

I 48

5,30

369,23

100,0

51,82

58,51

17,65

)9,93

8,42

21,56

Таблица 2

Состав (г(100 г) и калорийность диеты с дефицитом лизина, треонина, метионина и витаминов А,Е, С

Продукты

Количество, Содержание, г

Калорийность

1 1 белки жиры углеводы! 0,98

186, 16

2,58 „0,04

0,50

3,0

50,4

45,04

69,84

50,87

29,28

21, 73

7,5

0,16

0,67

7,8

)4,0

16,0

5;6

3,0

0,2

12,41

2,53

1,48

5,3

8,37

21,23

368,86

100,0

51,82

58,44

)8,02

20,32

Ф вЂ” Аминокислотный дисбаланс достигался путем замены каэеина на пшеничную клейковину.

++- Витаминная недостаточность моделировалась исключением иэ состава диеты витаминов А Е и С.

5 15 валось в 1,5-2 раза по сравнению с другими группами животных.

Таким образом, приведенные выше результаты показывают, что при условии использования биоматериала от животньж, содержавшихся на диете с дефицитом лизина, треонина, метионина и витаминов А,С и Е, обеспечивается достоверное повышение чувствительности способа.

Формула изобретения

Способ выявления вторичных мутагенов путем иик бадин исследуемого

Каэеин 17,0

Крахмал 50,4

Масло подсолнечное рафинированное 7,8

Отруби пшеничные )6,0

Сахароза 5,6

Солевая смесь, 3,0

Витаминная смесь 0,2

Всего 100

Калорийность, Х

Казеин

Крахмал

Масло подсолнечное рафинированное

Клейковина

Отруби пшеничные

Сахароза

Солевая смесь

Витаминная смесь

Всего

Калорийность,й вещества с микросомами печени в присутствии бактериальных клеток, отде- ления бактериальных клеток, посева

5 их на селективиую среду и регистрации числа колоний мутантных клеток в сравнении с контролем,,о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, 10 используют микросомы, выделенные из печени животных, содержащихся на диете, дефицитной по незаменимымаминокисло там: лизину, треонпну, метионину н витаминам А,С и Е не менее 1,5 месяцев.

l5l0366

Т аблица 3

Состав солевой смеси (мг/100г) Хлористый калий

Фосфорнокислый калий

Хлористый натрий

Углекислый пинк

Хлористый кобальт

Молибденовокислый аммоиий

Углекислый магний

Селеиит натрия

Сернокислая медь

Сернокислое железо

Сериокислый марганец

Алюмокалиевые квасцы

Иодистый калий

Фтористый натрий

Углекислый кальций

Фасфорнокислый кальций

Таблица 4

Состав витаминов (мг/IOO r) кальция

Биотин 0,01 фолиевая кислота 0,2

100, О !,0

8,5

Холин хлорнд

Викасол

Ниацин (витамин рр) Таблица 5

Иутагенная метаболнческая активация И-нитрозоморфолнна микросомами печени крыс, содержавшихся на различных диетах н индуцнрованных фенобарбиталом в дозе 80 мг/кг в течение трех дней (за IOOÕ принят уровень мутагенной активации N-нитрозоморфолина при использовании микросом неченн крйс, содержавшихся .на общевиварном рационе) Частота мутаций IO, У.

Питание

Общевиварный рацион

Сбалансированная полусинтетическая диета

Дефицит лизина, треоннна, метионина и витаминов А, С н Е

19,0+1,4

29,7+5,0

100

156 P ъ0,05

1 2,68 14,6

595 Р с0,001

Таблица 6

Иутагенная метаболнческая: активация циклофосфана микросомами печени крыс,содержавшихся на различных диетах и индуцнрованных фенобарбнталом в дозе 80 мг/кг в течение трех дней (за IOOX принят уровень мутагенной активации циклофосфана при использовании микросом печени крыс, содержавшихся на общевиварном рационе) Частота мутаций 10, й

Питание

43,4+2,7

66,6aI,9

Общевивариый рацион

Сбалансированная диета ДеФицит лизина, треоннна, г метионина и витаминов А, Сий

153 - P а0 001

229,Р с0,00) 99,6+6,1

Витамин А

Витамин К

Витамин С

Витамин О

Инозитол

5,0

lO,O

IОО,0. 0,25

20,0 1 6

19,45

4,3

0,37

0,16

2,03

923,7

421,05

Тиамив

Рибофлавнн

Пиридоксин

Циаикобаламин

Пантотенат

1,1

1,I

l,I

0,003

5 0

746,9

421,69

308,4

1,36

0,04

0,01

1 24,01

0,01