Способ получения биомассы бактерий providencia sтuаrтii, обогащенной рестриктазой р sт 1

 

Изобретение относится к микробиологической и химической промышленности, а именно касается способа получения биомассы бактерий PROVIDENCIA STUARTII с высоким содержанием рестриктазы P ST 1. Целью изобретения является повышение выхода биомассы и фермента. Для этого в качестве источника азота и витаминов используют рыбный гидролизат, в процессе выращивания на стадии достижения оптической плотности бактериальной суспензии 1,25-1,75 опт.ед. в среду вводят лактозу и свежую питательную среду, причем лактозу вводят в количестве 0,6-1,6 г/л (в виде 40%-ного раствора), а свежую питательную среду - в концентрации 10-20% по отношению к объему ферментера и процесс ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 2,5-3,5 опт.ед. В результате использования предложенного способа выход биомассы возрастает до 12,5-13,0 г/л культуральной жидкости, а выход рестриктазы повышается с 400-600 ед/г биомассы до 61000-66000 ед/г биомассы или с 3000-4800 ед/л культуральной жидкости до 762500-858000 ед/л культуральной жидкости.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

ССИЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY CBHQETEJlbCTB Y

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4324974/30-13 .(22) 04.11.87 (46) 30.10.89 Бюл. У 40 (71) Научно-производственное объединение "Биолар" и Научно-производственное объединение "Вектор" (72) Ю.Н.Бойков и В.Е.Репин (53) 577 15(088.0) (56) Smith D.I., Blattner F.R., Davies J. The isolation and partial

characterization of à new restriction endonuclease from Providencia

stuartii. — J. Nuc leic Ac. Res., 1976, ч. 3, Р 2 р. 343-353.

Sreen P.J., Heyneker Н.L. Bolivar F., Rodriguez R.L, Betlach M.Ñ., Covarrubias А.А., Backman К., Russel D.J., Tait R., Boyer Н.W. А general method vor the purification of

restriction enzymes. — Nucleic Acids

Res., 1978, v. 5, Р 7, р.2373-2380.

Лабораторная методика производства биомассы Providencia stuartii, утв. 03. 10.81.

Изобретение относится к микробио логической и химической промышленности, а именно касается способа получения биомассы бактерий Providencia stuar„„SU„„1 . 7 А1 (SD 4 С 12 И 1/20, 9/22 (C 12 И 1/20, С 12 К 1:01) 2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ БАКТЕРИЙ PRDVIDENCTA STUARTII, ОБОГАЩЕННОЙ

РЕСТРИКТАЗОЙ РБТ 1. (57) Изобретение относится к микробиологической и химической промышленности, а именно касается способа получения биомассы бактерий Providencia

stuart ii с высоким содержаниемрестрик- . таэы Pst 1. Цель изобретения — повышение выхода биомассы и фермента. Для этого в качестве источнг . азота и витаминов используют рыбнь. гидролизат в процессе выращивания на стадии достижения оптической плотности бактериальной суспензии 1,25- 1,75 опт. ед. в среду вводят лактоэу и свежую питательную среду, причем лактозу вводят в количестве 0,6-1,6 г/л (в виде 407ного раствора), а свежую питательную среду — в концентрации 10-20Х по огношению к объему ферментера и процесс ведут до достижения оптической плоf ности бактериальной суспензии 2,53,5 оп . ед. В результате использования предлагаемого способа выход биомассы возрастает до 12,5-13,0 г/л культуральной жидкости, а выход рестриктаэы повышается с 400-600 до до 61000-66000 ед./r бион:ассы или с 3000-4800 до 762500-858000 ед/л культуральной жидкости. т.х высоким содержанием рестрик|азы

Pst 1.

Цель изобретения — повышение выхода биомассы и фермента.

1518367

Способ осуществляют следующим образом.

В процессе культивирования вводят свежую питательную среду и лактоэу, ч1о позволяет культивировать клетки

Providencia stuartii до достижения оптической nJIOTHocrè бактериальной суспензии 2,5-3,5 опт.ед. (ФЭК, фильтр!0

Р 6, кювета 0,5 см).

При введении лактоэы в количествах менее 0,6 г/л (в виде 40Х-ного раствора), например 0,1 г/л, снижается выход биомассы и ферменга. Введение лактоэы в количествах более 1,6 г/л (в виде 40Х-ного раствора), например

2,1 г/л, приводит к снижению выхода биомассы и фермента. При этом происходит сильное закисление среды, в ко- 20 торой развитие бактерий Providencia

stuartii происходит слабо.

При введении свежей питательной среды в концентрации менее 10Х по отношению к объему ферментера (напри- 25 мер, 5Х) снижается выход биомассы и фермента.

При культивировании бактерий Providencia stuartii до оптической плотности бактериальной суспенэии менее

2,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр У 6, кювета

0,5 см), например 2,0 опт. ед., происходит снижение выхода биомассы и фермента, так как незавершен процесс постепенной ассимиляции лактозы и рыб35 ного гидролизата. При культивировании бактерий Providencia stuartii до оптической плотности бактериальной суспензии более 3,5 опт. ед. (например, 4,0 опт. ед.) происходит снижение вы- 40 хода биомассы и фермента, так как происходит старение кульгуры и наступает фаза отмирания клеток.

Пример 1. Оживление шгамма

Providencia stuartii 17 ВКПМ B-4076 45 осущесгвляют на сухом питательном агаре, содержащем 35 г/л сухого питательного агара и 1,Ол воды, в чашкахПетри.

Инкубируют в термокамере при 35"37 С в течение 16-18 ч.

С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалочные колбы с питательной средой, содержащей 50 г/л рыбного гидролиэага и до 1,О л воды. В каждой колбе находится 200 мл среды.

Культуру в колбах выращивают на качалке при 35-37 С в течение 16-18 ч. Посевной материал готовят иэ расчета SX по отношению к объему питательной среды, загруженной в ферменте.

Ферментацию культуры проводят в ферментере "Electrolux" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1,0 л воды, при: рН 72,-7,4; подаче воздуха 100 л/мин; перемешивании 300 об/мин, добавлении лактозы (в виде 40Х-ного раствора) при достижении оптической плотности бакгериальной суспенэии

1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см) в количестве 1,6 г/л (75 г лактоэы и 187,5 мп воды), добавлении 20Х свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт.ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 13,0 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктаэы Pst 1: 66000 ед/г биомассы, S58000 ед/л культуральной жидкости .

Для определения активносги использован метод электрофореэа в геле.

Активность определяют в конце выделения (после хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой).

3а единицу активности рестриктазы

Рег 1 принимают количество фермента, которое требуется для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при 37 С.

Выделение фермента проводят следующим образом.

50 r биомассы бактерий суспендируют в 100 w: 10 мИ трис-НС1 буфера (рН 7,2), содержащего 10 мИ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ азида натрия, 1 ьИ трилона Б (буфер "А"), и доводят этим же буфером до объема 150 мп. К суспензии добавляют 1,5 мл 10Х-ного тритона Х-100 и 150 мг лиэоцима. Лиэис проводят 1 ч при постоянном перемешиваиии. Дальнейшее фракционирование лиэата проводят в системе двухфазного разделения.

Полученный лиэат добавляют к смеси, сосгоящей иэ 37,0 мл 15Х-ного водного раствора декстрана T-500, 56 мп ЗОХ" ного водного раствора полиэтиленглико5 1518 ля (ПЭГ) и 35 мп 4,0 М хлористого натрия (рн смеси 6, 5) . Тщательно перемешивают в течение 1 мин и центрифугируют на центрифуге "High speed (20000 х g, 20 мин). Верхнюю ПЭГ-фазу

5 объемом 120 мп, содержащую фермент, отбирают, разбавляют двухкратный объемом буфера "А", добавляют тритон Х100 (0,1Х) и наносят на колонку с фосфоцеплюпозой, уравновешенную буфером "А", содержащим 0,1Х тритона

Х-100 (буфер "Б"). .Фермент элюируют

0-1,0 М линейным градиентом концентрации натрия хлористого в буфере "Б".

Фракции, содержащие рестриктазу Pst 1, концентрируют диализом против буфера

"Б", содержащего 55Å глицерина.

Получают очищенный фермент Pst 1 в виде прозрачной бесцветной жидкос- 20 ти.

Рестриктаэа Pst 1 расщепляет ДНК фага Л на 18 сайгов.

Содержание нуклеаз — после выделения отсутствуют. 35

Хранят рестриктазу Pst 1 при — 10 С в течение 1 r.

Пример 2. Оживление культуры и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ферментере "Electrolux" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизаra и до 1,0 л воды, при: рн

7, 2-7,4, подаче воздуха 100 л/мин, перемешивании 300 об/мин, добавлении лактоэы (в виде 402-но- 40

ro pacrsopa) при достижении оптической плотности бактериальной суспенэии

1,5 опт. ед. (ФЭК, фкпьтр Р 6, кювета

0,5 см) в количестве 1,1 г/л (50 r лактоэы и 125 мл воды) добавлении 15Х свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспенэии 1,5 опт.ед. (ФЭК, Фильтр N> 6, кювета 0,5 см) 7,5 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотHocTH бактериальной суспензии 3,0 опт. ед. (ФЭК, фильтр У 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 12,75 г/л куг. ьтуральной жидкости.

Выход рестриктаэы Pst 1: 63500 ед/г биомассы, 809625 ед/л культуральной жид кос ти .

367 6

Определение активности, выделение фермента Pst I .и хранение проводя f подобно примеру

П р и и е р 3. Оживление культуры и выращивание посевного материала проводя. подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ферменте "Electrolux" с рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1,О л воды, при: рН 7,2-7,4 подаче воздуха 100 л/мин, перемешивании 300 об/мин, добавлении лактозы (в виде 407ного раствора) при достижении оптической плотHocти бактериальной сус,пензии 1,25 опт. ед. (ФЭК, фипьтр

N 6, кюве à 0 5 см) в количестве

0,6 г/л (?5 г лактоэы и 62,5 мл воды) добавлении 10Х свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,25 опт. ед. (ФЭК, фильтр М 6, кювета 0,5 см) в количестве 5,0 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспенэии 2,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 12,5 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 61000 ед/г биомассы, 762500 ед/л культуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Pst 1 н хранение проводят подобно примеру 1 °

Пример 4 . Оживление культуры и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ° ферментере "Electrolux" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1,0 л воды, при: рН 7, 2-7,4 > подаче воздуха 100 л/мин, перемешивании 300 об/мин, добавлении лактозы (в виде 407-ного раствора) при достижении оптической плотности бактериальной суспензии клеток 0,75 опт.ед. (ФЭК, фильтр

Ф 6, кювета 0,5 см) в количестве

1,6 г/л (75 г лактозы и 187,5 мп воъ добавлении 207 свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед.

1518367 (ФЭК, фильгр Р 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бакгери5 альной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 5,6 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 31250 ед/rtp биомассы; 175000 ед/л культуральной жидкости.

Пример 5. Оживление культуры и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1. 15

Ферментацию культуры проводят в ферментере "Electrolux" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 10 л воды, при: 20 рН 7,2-7,4, подаче воздуха 100 л/мин, перемешивании 300 об/мин э добавлении 2ОХ свежей среды при достижении оптической плотности бакте-25 риальной суспензии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см) в количесгве 10 л добавлении лакгозы (в виде 40Х-ного раствора) при достижении оптичес- 30 кой плотности бактериальной суспензии

2,25 опт. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см) в количесгве 1,6 г/л (75 r лактозы и 187,5 мл воды).

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плогности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр 9 6, Klosera 0,5 см).

Выход биомассы 6,6 г/л культуральной жидкости. 40

Выход рестриктазы Pst 1: 34200 ед/г биомассы, 225720 ед/л культуральной жидкости.

Пример 6 ° Оживление культуры 1 и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ферментере "Electrolux" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизага и до 1 л воды, при: рН 7,2-7,4 > подаче воздуха 100 л/мин, пер емешива нии 300 об/мин добавлении лактоэы (в виде 40Х-но55 го раствора) при досгижении опгической плотности бактериальной суспенэии

1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см) в количесгве 1,6 г/л (75 г лактоэы и 187,5 мп воды) .

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 оп r. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 cM).

Выход биомассы 7,6 ед/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 40500 ед/г биомассы, 307800 ед/л культуральной жидкости, Пример 7. Оживление культуры и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1.

Ферментацию культуры проводят в ферментаторе "Electrolux" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролиЬата и до 1 л воды, при: рН 7, 2-7,4, подаче воздуха 100 л/мин, перемешивании 300 об/мин, добавлении 20Х свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л.

Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см).

Выход биомассы 8,2 ед/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1: 37000 ед/г биомассы; 303400 ед/л культуральной жидкости.

Таким образом в результате использования предлагаемого способа выход биомассы возрастает с 7,5-8,0 до

12,5-13,0 г/л культуральной жидкости, а выход рестриктаэы Pst 1 повышается с 400-600 до 61000-66000 ед/г биомассы или с 3000-4800 до 762500858000 ед/л культуральной жидкости.

Формула изобретения

Способ получения биомассы бактерий

Providencia stuartii, обогащенной рестриктазой Pst 1, включающий культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники аминного азота и витаминов при аэрации и пе) ремешивании, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода биомассы и фермента, в качестве источника аминного азота и витаминов ис10

1518367

Сос гавитель H.Ходарев

Редактор M.Ïåòðîâà Техред A. Кравчук Корректор M.Максимишинец

Заказ 6567/30 Тираж 501 Попписное

РчИИПИ Государственного комитета по иэобрет . ням и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 пользуют рыбный гидролизат, в процессе выращивания на стадии достижения оптической плотности бактериальной суспензии 1,25-1,75 опт. ед. в среду вводят лактозу и свежую питательную среду, причем лактозу вводят в количес тве О, 6-1, 6-г/и, а свежую пи га гельную среду — в конценграции 10-207. по отношению к объему ферментера и процесс ведут до достижения оптической плотнос и бактериальной суспензии 2,53,5 опт. ед.