Устройство для регистрации макроскопических токов через участок наружной мембраны клетки или изолированного органоида

 

Изобретение относится к физиологии клетки, а более конкретно к устройствам исследования клеточных мембран преимущественно растительного происхождения. Цель изобретения - повышение точности регистрации токов за счет компенсации паразитных параметров микропипетки - достигается за счет введения повторителя, дополнительного электрода, двух переключателей и двух калибровочных резисторов. Эти узлы позволяют подготавливать устройство к работе без прикосновения к мембране клетки, что гарантирует отсутствие возникновения стрессовой проводимости мембраны. 1 ил.

СОК)3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 С 12 М 3/00

I 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР! (21) 4307933/31-13 (22) 03.08.87 (46) .07,11.89. Бюл. 11 41 (71) Казанский институт биологии

Казанского Филиала АН СССР (72) И.Х.Нуриев и Г.А.Великанов (53) 576.3.093.6(088.8) (56) Регистрация одиночных сигналов.

/Под ред. Б.Сакмана и Э.Неера.- М.:

Мир, 1987, с. 166. (54) УСТРОЙСТВО ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ

МАКРОСКОПИЧЕСКИХ ТОКОВ ЧЕРЕЗ УЧАСТОК

НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ КЛЕТКИ ИЛИ ИЗОЛИРОВАННОГО ОРГАНОИДА (57) Изобретение относится к физиоИзобретение относится к физиологии клетки, а более конкретно к .устройствам исследования клеточных мембран, преимущественно, растительного происхождения °

Цель изобретения — повышение точности регистрации токов за счет компенсации паразитных параметров микро" пипетки.

На чертеже представлена функциональная схема устройства для регистрации макроскопических токов через участок наружной мембраны клетки или изолированного органоида.

Устройство для регистрации макроскопических токов через участок наружной мембраны клетки или изолированного органоида содержит два операционных усилителя 1 и ?, три резистора 3-5, два конденсатора 6 и 7, „„SU„„1520092 A 1

2 логии клетки, а более конкретно к устройствам исследования клеточных мембран преимущественно растительного происхождения. Цель изобретения повышение точности регистрации токов за счет компенсации параэитных параметров микропипетки - достигается эа счет введения повторителя, дополнительного электрода, двух переключателей и двух калибровочных резисторов. Эти узлы позволяют подготавливать устройство к работе без прикос" новения к мембране клетки, что гарантирует отсутствие возникновения стрессовой проводимости мембраны.

1 ил. усилитель 8 с регулируемым коэффици- ентом усиления, два переменных резистора 9 и 10, общую шину, стеклянную микропипетку 11, заполненную раствором с двумя электродами 12 и 13 в ней, один из которых подключен к первому входу операционного усилителя 1, второй послеДовательно через резистор 3 - к выходу операционного усилителя 1, второй вход и выход которого соединены через резистор 4, а между входами его последовательно через конденсатор 6 подключен усилитель 8 с регулируемым коэффициентом усиления, второй вход операционного усилителя 1 и первый вход операционного усилителя 2 соединены через переменный резистор 9, а первый вход и выход операционного усилителя 2 через параллельно соединенные конден1520092!

О !

55 сатор 7 и резистор 5. Кроме того, устройство снабжено повторителем 14, дополнительным электродом !5, двумя переключателями 16 и 17 и двумя калибровочными резисторами 18 и 19

Одна клемма переключателя 16 и повторитель 14 подключены к дополнительному электроду 15, вторая клемма этого переключателя соединена с первым калибровочным резистором 18, первая клемма переключателя 17 связана с первым входом операционного усилителя 2, к второй и третьей клеммам которого подключены соответственно второй калибровочный резистор 19 и переменный резистор 10, а третья клемма переключателя 16 и остальные выводы переменного резистора 10 и калибровочных резисторов 18 и 19 — к общей шине. Усилитель 8 с регулируемым коэффициентом усиления с последовательно включенным конденсатором

6 предназначены для компенсации паразитной емкости микропипетки 11.

Переменные резисторы 9 и 10 служат соответственно для компенсации последовательного сопротивления микропипетки 11 и сопротивления утечки в зоне контакта микропипетки ll с мембраной клетки или органоида. K дополнительному электроду 15 подключен повторитель 14 с большим входным сопротивлением и служит для контроля точности компенсации паразитных параметров микропипетки 11. Переключатели 16 и 17 предназначены соответственно для подключения калиброванного резистора. !8, имитирующего утечку в зоне контакта калиброванного резистора 19 — точно компенсирующего эту искусственно введенную утечку.

Для устойчивой работы устройства необходимо выполнение условия, при котором глубина ООС операционного усилителя 1 больше или равна глубине ПОС, в противном случае операционный усилитель 1 возбуждается и амплитуда возбуждения от пика до пика определяется номиналами питающих напряжений и типом операционного усилителя. При работе с известным устройством это возбуждение при прикосновении к мембране клеток растительного происхождения приводит к появлению стрессовой проводимости.

Глубина ООС определяется делителем, состоящим из резистора 3 (Rl) и последовательного сопротивления микропипетки 1! (К „„), а глубина ПОС ре- . зистэром 4 (! 2) и значением переменного резистора 9 (!!3). Для обеспечения устойчивости, таким образом, требуется выполнение соотношения

И К2

R3

На операционном усилителе 2 выполнен дифференциальный усилитель, одновременно являющийся измерителем тока. Неинвертирующий вход операционного усилителя 2 является входом устройства и операционный усилитель

2 за счет наличия обратной связи на своем инвертирующем входе поддерживает уровень напряжения поданного на вход устройства, На неинвертирующий вход операционного усилителя 1 подается напряжение через делитель, образованный резисторами 9 и 4, что вызывает протекание тока по цепи ПОС и ООС операционного усилителя 1, причем протекающие токи обратно пропорциональны сопротивлениям резисторов обратной связи (ООС) R2

Это означает, что при равенстве глубины ООС и ПОС на кончике микропигетки 11 поддерживается напряжение, присутствующее на неинвертирующем входе операционного усилителя 2, которое поддерживается равным напряжению на входе устройства.

Таким образом обеспечивается фиксация напряжения на участке мембраны при проведении регистрации тока.

Ток, текущий через микропипетку

11, целиком протекает через резистор

3 обратной связи, при этом хлорсеребряный электрод 12 служит для соединения двух типов проводников - раствора в пипетке с ионной проводимостью и элементов схемы с электронной проводимостью. Хлорсеребряный электрод

13 является электродом сравнения операционного усилителя l,. через этот электрод отсутствует прохождение тока вследствие очень большого входного сопротивления операционного усилителя 1. Назначение электрода 13 передача на инвертирующий вход операционного усилителя 1 напряжения в микропипетке 11. При использовании для этой цели электрода 1 может появиться погрешность, связанная с эффектами поляризации этого электрода

5 1520092

6 при длительном прохождении тока через кой: резистор 5 (R3) и конденсатор 7 него. (С2) 30

R1 Бgr

R2 k5 где R - эквивалентное сопротивлефг ние утечки.

При обеспечении этого условия измеритель тока на операционном усилителе 2 регистрирует ток, который пропорционален току через участок мемб" раны

Usbix

40 где 11 вы, - напряжение на выходе А2

I „, - ток, протекающий через участок мембраны, 50 откуда может быть получено собственно значение тока

1 вы R2

R3

Для обеспечения уменьшения уровня высокочастотных шумов используется конденсатор 7, который задает частоту среза фильтра, образованного цепоч55

ТоК проходящий через резистор 3, представляет из себя сумму токов

5 утечки через сопротивление утечки в зоне контакта микропипетки 11 с мембраной и собственно тока, проходящего через участок мембраны, находящийся 10 под микропипеткой 11, который состоит иэ тока утечки мембраны, связанного с неспецифичной проводимостью, и тока, связанного с активизацией ионных каналов мембраны.. 15

При работе с устройством осуществляется компенсация токов утечки через сопротивление утечки в зоне контакта и тока утечки собственно через мембрану. Для осуществления компен- 20 сации используется тестовый сигнал переменной частоты малой амплитуды, не вызывающий активизации ионных каналов, при этом устройство регистрирует только ток утечки через сопротивление утечки в зоне контакта и ток утечки через участок мембраны.

Для компенсации токов утечек используется переменный резистор 10. Ком- пенсация осуществляется путем отвода из текущего в цепи ПОС через резистор 4 (R5) тока, который пропорционален току, проходящему через микропипетку, и тока, пропорционального току утечки, Для обеспечения этого должно выполняться условие

f Г 27К3 С2

Переключатели 16 и 17 и калиброванные резисторы 18 и 19 предназначены для осуществления компенсации паразитных параметров микропипетки 11 при подготовке устройства к работе.

Подготовка устройства к работе осуществляется следующим образом.

Микропипетка 11, заполняемая раствором, вводится в раствор, где находится электрод 15. Переключатели 16 и 17 переводятся в правое положение по схеме, при этом обеспечивается подключение резисторов 18 и 19..На вход устройства "Вход" подается тестовый сигнал переменной частоты с известной амплитудой, например прямоугольной или треугольной формы. После этого контролируется сигнал на выходе повторителя 14. При наличии возбуждения изменением сопротивления резистора 9 добиваются исчезновения возбуждения, затем регулировкой коэффициента усиления усилителя 8 добиваются, чтобы форма сигнала на выходе "Вых. 2" совпадала с формо" сигнала, поданного на вход устройства

"Вход". После этого, путем регулировки сопротивления переменного резисто- ра 9 и корректировки коэффициента усиления усилителя 8, добиваются совпадения формы и амплитуды сигнала на выходе "Вых. 2" с сигналом, поданным на вход устройства "Вход". На этом завершается компенсация параэитных параметров микропипетки 11. При выполнении этой процедуры резистор 18 имитирует искусственную утечку, сопротивление резистора 16 выбирают сравнимым с сопротивлением утечки в предстоящих исследованиях. Сопротивление резистора 19 (P7) определяется из соотношения

R1 R6 Кб ° R2

=) R7 = — — "R2 R7 R1

После выполнения описанйой процедуры гарантируется отсутствие возбуждения операционного усилителя 1 при проведении регистрации.

Для проведения регистрации микропипетку 11 подводят к мембране, на вход устройства "Вход" подают сигнал малой амплитуды, не вызывающий акти1520092 вации ионных каналов данного объекта.

После этого переключатели 16 и 17 переводят в левое по схеме положение и, контролируя сигнал на выходе устройства "Вых. 1", изменяя сопротивление резистора 10 (К5), добиваются исчезновения сигнала на выходе

"Вых, 1". На этом заканчивается этап компенсации сопротивления утечки, устройство готово к работе и в объекте, через участок мембраны которого требуется регистрировать ток, отсутствует стрессовая проводимость. На вход устройства "Вход" можно подавать сигнал, который поддерживается на участке мембраны и регистрирует ток через участок мембраны под микропипеткой 11, который определяется

Беых R2

R1 R3 где U „„- напряжение на выходе устройства "Вых. 1".

Использование новых элементов: резисторов 18 и 19, переключателей 16 и 17, и изменение вследствие этого методики подготовки устройства к работе выгодно отличает предлагаемое устройство от известного, так как позволяет осуществить подготовку уст- 30 ройства к работе без прикосновения микропипетки к мембране исследуемого объекта, что предотвращает возможность возникновения стрессовой проводимости мембраны исследуемого объекта и позволяет применить предлагаемое устройство к большому классу малоизученных, s плане работы и физиологической роли ионных каналов, объектов растительного происхождения, а также 40 увеличивает производительность устройства, так как предлагаемое устройство позволяет одновременно выполнять подготовку объекта и устройства. формула изобретения 45

Устройство для регистрации макроскопических токов через участок наружной мембраны клетки или изолированного органоида, содержащее два операционных усилителя, три резистора, два конденсатора, усилитель с регулируемым коэффициентом усиления, два переменных резистора, общую шину, стеклянную микропипетку, заполненную раствором с двумя электродами в ней, один из которых подключен к первому входу первого операционного усилителя, второй последовательно через первый резистор — к выходу первого операционного усилителя, второй вход и выход которого соединены через второй резистор, а между входами его последовательно через первый конденсатор подключен усилитель с регулируемым коэффициентом усиления, второй вход первого и первый вход второго операционных усилителей соединены через первый переменный резистор, первый вход и выход второго операционного усилителя соединены через параллельно соединенные второй кон= денсатор и третий резистор, о т л и ч а ю ul е е с я тем, что, с целью повышения точности регистрации за счет компенсации паразитных параметров микропипетки, оно снабжено повторителем, дополнительным электродом, двумя переключателями и двумя калибровочными резисторами, одна клемма первого переключателя и повторитель подключены к дополнительному электроду, вторая клемма этого переключателя соединена с первым калибровочным резистором, первая клемма второго переключателя связана с.первым входом второго операционного усилителя, к второй и первой клеммам которого подключены соответственно второй калибровочный и второй переменный резисторы, а третья клемма первого переключателя и остальные выводы второго переменного и калибровочных резисторов - к общей шине.

1520092

Составитель А.Чалый

Техред А.Кравчук

Корректор M. Самборская

Редактор И.Дербак

Заказ 6722/28 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, И-35, Раушская наб., д ° 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина,101