Способ получения тромбина

 

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, а именно к способу получения тромбина, применяемого в биоорганической химии. Цель изобретения - увеличение выхода и активности целевого продукта. Согласно предлагаемому способу получение тромбина из активированной протромбиновой сыворотки крови проводят методом аффинной хроматографии на аминогексилагарозе, модифицированной карбобензоксипроизводными дипептидов D-фенилаланил-D-аргинина или D-аргинил-D-фенилаланина, осуществляя адсорбцию белков из 0,05 М трис-буфера в присутствии 0,1 М NACL при PH 7,9-8,1, промывая колонку 0,5 М раствором NACL и вымывая адсорбированный тромбин из колонки совместными линейными градиентами хлористого натрия от 0,5 до 1,0 М и изопропилового спирта от 0 до 50% при PH 7,9-8,1. 2 табл., 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (I I) (511 4 С 12 М 9/74

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К А BTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4395204/31-13 (22) 21.03.88 (46) 07.12.89. Бюл. У 45 (71) Институт химической и биологической физики АН ЭССР и Институт биоорганической химии AH УССР (72) M.Э..Xara, А.А.Аавиксаар, M.M.Ðàáà, С.А. Пояркова, Л.П.Швачко и В.К. Кибирев (53) 663.65(088.8) (56) Hatton M.W.C., Regoeczi Е. The

affinity of human, rabbit and Ъо 1пе

thrombine for sepharose-lysine and

other conjugates.Biochem. Biophys

Acta, !976, ч.421, р. 575-585.

Уи Х . I., Fischer А.М . et al. Affinity chromatography of thrombin on

modified polystyrene resins.-J.Chromat, 1986, v.376, р.429-435. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБИНА (57) Изобретение относится к произ—

Изобретение относится к производству ферментных препаратов, а именно к способу получения тромбина, применяемого в биоорганической химии.

Целью изобретения является увеличение выхода и удельной активности целевого продукта.

Согласно предлагаемому способу получения тромбина иэ активированной протромбиновой фракции сыворотки крови, включающему центрифугирование и аффинную хроматографию, аффинную хроматографию проводят на аминогексилагароэе, модифицированной карбобензоводству препаратов, а именно к способу получения тромбина, применяемого в биоорганической химии. Цель изобретения — увеличение выхода и активности целевого продукта. Согласно предлагаемому способу получение тромбина из активированной протромбиновой сыворотки крови проводят методом аффинной хроматографии на аминогексилагароэе, модифицированной карбобенэоксипроизводными дипептидов D-фенилаланил-D-аргииина ипи

D-аргинил-D-фенипаланина, осуществляя адсорбцию белков иэ 0,05 М трисбуфера в присутствии 0,1 M NaC1 при рН 7,9-8,10 промывая колонку 0,5 М . раствором NaC1 и вымывая адсорбированный тромбин иэ колонки совместными линейными градиентами хлористого натрия от 0,5 до 1,0 M и изопропилового спирта от О до 50Х при рН

7,9-8,1 . 2 табл ., 1 ил . ксипроиэводными дипептидов D-фенилаланил-D-аргинина или Р-аргинил-D-фенилаланина, осуществляя адсорбцию белков из 0,05 М трис-буфера и в присутствии 0,1 М NaC1 при рН 7,9-8,1 промывая колонку 0,5 М раствором

NaCl и вымывая адсорбированный тромбин из колонки совместными линейными градиентами хлористого натрия 0,51,0 М и изопропипового спирта О507 при рН 7,9-8.1.

Сущность предлагаемого способа заключается в применении в качестве аффинного лиганда карбобенэоксип1 о1527261 иэводных дипептидов, полученных из

D-фенилаланина и D- аргинина. На аффинном сорбенте, синтезированном иэ аминогексилагарозы и названных пепS тидов, тромбин адсорбируется существенно сильнее примесей, которые можно вымывать нз колонки до десорбции тромбина. Тромбин вымывается в совместных градиентах хлористого 10 натрия и иэопропилового спирта.

Пример 1. Синтез аффинных колонок 20 г аминогексилагарозы (приблизительно 65 мл геля) промывют на стеклянном фильтре последовательно водой (400 мл), 0,1 М раствором

На СО (200 мл), водой (200 мл), переводят в диметилсульфоксид (CO).

Для этого гель промывают последовательно 26-, 50-, 75- и 100Х-ными растg0 ворами ДИСО по 200 мл . Применяют РМСО, который выдерживают в течение суток над гранулами КОН и перегоняют под уменьшенным давлением над гранулами

КОН, 4 г карбобенэоксипроизводного 25 дипептидов Р-фенилаланил-Э-аргинина или D-аргинил-D-фенилаланина растворяют в 60 мл ДИСО. В полученном растворе суспендируют аминогексилагарозу и прибавляют 4 r дициклогексилкарбодиимида. Продолжительность проведения реакции при постоянном перемешивании на качалке при комнатной температуре 15 ч. Полученный сорбент промывают на стеклянном фильтре последо- 35 вательно ДМСО, этанолом, 50 -ным этанолом и водой (каждого по 300 мл).

Пример 2 ° Соответственно примеру 1 синтезируют аффинные сорбенты со следующими лигандами:карбобензокси 40

-D-фенилаланил-0-аргинии и карбобензокси-D-аргинип-Р-фенилаланин, Полученными сорбентами заполняют колонки размерами 1,5) 30 см, которые уравновешивают 0,05 М и тряс-НС1 с 0,1 M 45

NaC1.

Протромбин получают иэ плазмы донорской крови исходным из III фракций по Кону. Протромбин активируют добавлением суспензии тромопластина э приО сутствии СаС1< при 37 С в течение

30 мин, рН 7,4. Затеи нерастворимую часть отделяют на ультрацентрифуге

УАС-25 при 15000 об/мин в течение

28 мин. Полученный раствор диализуют против 0,05 M и трис-НС1 с О,l М NaC1, 55 .Э рН 8,0 и наносят на колонку. После нанесения пробы колонки промывают

0,05 M и трис-НС1 буфером, содержащим 0,5M NaC1 рН8,0,Адсорбированный тромбин вымывают из колонок с совместными градиентами хлористого натрия (0,5-1,0 М) и изопропилового спирта (О-50 ) на 100 мл 0,05 M трис-НС1 с 0,5 M NaC1, рН 8,0 и

100 мл 0,05 М трис-НС1 с 1,0 M NaC1 в 50Х-ном иэопропиловом спирте, рН

8,0. Собирают фракции по 6 мл. Ак тивность тромбина в первоначальном растворе и во фракциях определяют по скорости свертывания 0,1Х-ного раствора фибриногена под действием фермента. B 1 мл раствора фибриногена в 0,001 M трис-НС1 буфере с

0,15 M NaC1, рН 7,4 добавляют 20 мкл исследуемого раствора тромбина и определяют время свертывания.

На чертеже показана калибровочная кривая активности тромбина, которая построена по данным, полученным тромбином с известной активностью.

Фракции, содержащие тромбин, объединяют и определяют оптическую плотность при 280 нм и ферментативную активность. Полученные реэувьтаты представлены в табл.1(объем наносимой пробы 50 мл). При расчете содержания тромбина в миллиграмма учитывают, что его 1Х-ный раствор имеет при 280 нм оптическую плотность 18,7.

Из табл. 1 видно, что при проведении аффинной хроматографии при комнатной температуре, происходит некоторое уменьшение выхода по активности и получаемые препараты тромбина менее активны. Однако их активность превьппает активность известных препаратов.

П р е р 3. Колонку с размерами 1,2<13 см заполняют аффинным сорбентом, синтезированным по примеру 1 и имеющим в качестве пептидного лиганда карбобензокси-D-аргинил-D-фенилаланин, Колонку уравновешивают

0,05 M и трис-НС1 буфером с 0,1 M

NaC1. рН растворов уравновешивания, нанесения пробы и вымывания адсорбированных веществ изменяют в пределах

7,2-8.5. Все операции проводят при комнатной температуре. Перед нанесением пробы из раствора удаляют осадок центрифугированием. Порядок нанесения пробы и элюирование не отличаются от приведенного в примере 2.

Объем пика тромбина 24 мл. Результа1527261

Таблица 1

Лиганд на сорбенте активность тромбина после хроматографии

N.1.Н ./мг

Температура раздео ления, С

Исходная активВыход по активно сти, Х ность, N.1.Н ед./мг

Kbz-D-Phe-D-Arg

Kbz-D-Arg-D-Phe

22

Таблица 2

Активность тромбина после хротографии, N.1.Н. ед./мг

Выход по активности, Х рН разделения

64

78

78

2250

7,2

7,8

8,0

8,2

8,5 ты разделения представлены в табл.2 (очистка тромбина на аффинной колонке с карбобензокси-D-аргинил-D-аланинагарозой, объем наносимой пробы !

5 мл, исходная активность 2600

N.).Н ед./мл Ю»во 9 00) °

Из приведенных в табл.2 данных видно, что предлагаемая аффинная колонка позволяет получить высокоактивный препарат тромбина с хорошим выходом лишь в узком интервале рН.

Предлагаемый способ позволяет получать в одну стадию с выходом 9099Х препарат тромбина с удельной активностью до 6000 N.l Н ед./мг.

Сорбенты, используемые при предлагаемом способе, обеспечивают достаточно высокий выход фермента ° Ðàнее для получения тромбина эти сорбенты не использовались.

Предлагаемый способ технологичен, сорбенты можно испольэовать многократно. Их сорбционные свойства восстанавливаются после промывания колонки градиентом иэопропипового спирта от 50 до OX.

Формула изобретения

Способ получения тромбина иэ активированной протромбиновой фракции сыворотки крови путем аффинной хроматографии, проводя нанесение пробы в 0,05 М трис-НС1 буфере, содержащем 0,1 М NaCl, с последующей элю10 цией тромбина, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения выхода и активности целевого продукта, аффинную хроматографию осуществляют при рН 7,9-8,1 на аминогексипf5 агарозе, модифицированной карбобензоксипроизводными дипептидов D-фенилаланил-D-аргинина или. D-аргинил-D-фенилаланина, проведением после нанесения пробы отмывки сорбента с од20 новременным удалением балластных белков 0,05 М трис-НС1 буфером, содержащем 0,5 И NaC1 осуществлением элюции тромбина тем же буфером с совместными линейными градиентами хло25 ристого натрия 0,5-1,0 Y и изопропилового спирта 0-50Х.

Средняя Максимальпо пику ная

283 4100 6000 99

208 3050 5100 88

283 3300 5000 90

1527261

Составитель А. Карякин

Техред М.Дидд)к Корректор М. Васильева

Редактор О. Ррковецкая

Заказ 7481/34

Тираж 501

Подп ис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101