Способ получения ферментных мембран

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ферментных мембран, которые могут найти применение в измерительных приборах на основе ферментных электродов для определения метаболитов, физиологически важных соединений и ферментной активности. Цель изобретения - улучшение качества целевого продукта за счет расширения диапазона измеряемых концентраций субстратов ферментов. Способ получения ферментных мембран заключается в связывании ферментов с нерастворимым пленочным носителем в присутствии глутарового альдегида и сывороточного альбумина. В качестве носителя используют микропористые ядерные фильтры с пористостью 0,02 - 3,0%, приготовленные из лавсановой пленки путем ее облучения в ускорителе ионами инертных газов с последующим травлением в растворе щелочи. Способ позволяет получить ферментные мембраны, пригодные для измерения концентраций субстратов ферментов в диапазоне их концентраций 4 - 10 мМ, тогда как известные мембраны пригодны только до концентрации 1,5 - 2 мМ. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

11 „-Ь,:е

:. <ЭГ « < ф< ":|. н < :<.|

;l i.,

)« |< f Ii. Н1; i

l lr- <

Г т (3< <се,,ро, <т за с |ет

)на .<з<леряемь<. ; ко!<)В +;..Г)!.<ЕН-ОВ.,lr II) П

Ег:,.с ., ф !) 1< <. <«в

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИВГ!БРЕТЕ< ОТКР-1,Щ|, при Гянт ссср (21) 4403365/31. 13 (22) 15.04.88 (t16) I 5 0 I «0 . be!I ,!" rIИ<,, b. < ряВИЧЕНЕ, < . 8, !1(. < | я «< < «. и < . —, „А ..П <а У р и н а в и ч ю с (53) 5;7,! 5: !.<88 8) (56) Кулис 6.!О д»алит|<ческие с!.стемы на <<:H ;e <ммобилизован|1ых ферментов.

i. ill.r|ЮС: ИО<<СЛ <., I, 81, . 200.

Л(! тОрС|.ОО С |яд<-, ПЬСТВО CL .Р

11 524 .1,, II 03, !9/ ) <1:,збр(-. r 1<;ие Относ!. Гcí к Оиот(. .х<огог !, а, « .! !,о,< спо..обам получеф(<РМОHTH I:< rl ; r

««1Н О| <р r!r ЛЕ « 1П <) — Габо<|нiое, фИЗИОЛО ! !

< |! | l; СОЕПИНЕНИЙ И 1В . | =<К|И . ",<С !.

1<)(<.. н, < Я ., Л ИШЕНИЕ Ка (., << < я в связь<вании с Г!з <,, вой Н! f1 pr3Hc!v!

„„SU „„I 535892 (51) 5 C 12 N 11708, 11/00

2 ной активностл. Цель изобретения улучшение качества целевого продукта за счет расширения диапазона измеряемы. конц.-нтраций Губстратов фермен|Ов. Способ получения ферментных мемСр<,Н заключается в cpÿçûâàíèè ферментов с нерастворимым г|леночным носителем в присутствии глутарового альдегида и сь<вороточного альбумина. В качестве носителя используют микропорис г(,«е ядерные фильтры с пористостью

0,02-3,0, приготовленнь<е из лавсановой пленки путем ее облучения в ускорите |е иона 11< инертных газов с пocf<åдующим травп<нием в растворе щелочи.

Способ позволяет получить ферментные мембраны, пригодные для изл(енени

3 табл. путем обработки глутаровы(л альдегидом в присутствий сывороточного ,альбумина. При этом используют ядерный ф|лльтр с пористостью 0,02-3,01, получен||ый из лавсановой пленки путем (-.е обработки 1онал|и инертных f азов с последующим травлением в растворе щег<очи, Способ позволяет получить ферментные мембраны, пригодные для из!.ерения концентраций субстрато- ферментов 4-100 <«Л< (вместо 1,52 MN).

П р и; е р 1. Проводят травление ядерного фильтра толщиной 10 мкм

1535892

25 Ъ

40

204-ным раствором едкого натра при

50 С. Пористость получаемых при этом ядерных фильтров зависит от времени травления (табл.l). Она составляет

0,02-31. Для приготовления ферментного слоя 1600 ед. глюкозооксидаэы растворяют в 0,6 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 6,8, добавляют 0,4 мл 4,5"ьного сывороточного альбумина и

0,04 мл 253-ного глутарового альдегида. Эту смесь тщательно перемешивают и выливают на ядерные фильтры размерами 20х20 см. На поверхность приготовленных двухслойных мембран надевают ацетатцеллюлозную мембрану толщиной 10 мкм. Полученные трехслойные мембраны помещают в холодильник на 24 ч. Затем разрезают на куски диаметром 2 мм и накладывают на Pt электрод (с Pt электродом контактирует ацетатцеллюлоэная мембрана) и определяют ток электрода при рН

7,2 и 19 С, задавая 0,6 В отн.

Ag/AgC1 электрода.

Зависимость чувствительности электрода и диапазона линейного участка калибровочных графиков от пористости мембраны приведена в табл, 1.

А алогично примеру 1 -отозя; тэехслойную мембрану с испольэса:л макропористой мембра ы по иэ":-"..г, у способу (пористостb 4, б), 1 ..а, и линейного участ-;а градуировоч «ого гра<ри,-а при использоь..нии э,. мембраны составляет 1,9 мИ., а i,"вствительность - 21,6 нА/мИ.

Пример 2. Аналогично примеру

1 изготавливают ферментную мембрану для определения этанола с использованием алкогольоксидазы. Для сравнения параллельно используют макропористую мембрану по прототипу °

В табл. 2 приведены сравнительные параметры полученных электродов.

Из этих данных следуе, что линейность градуировочных графиков в случае использования ядерных фильтров наблюдается до 30 мМ в случае электро да 2, до 15 мИ (3), до 7,5 мИ (4) и до 5 »М (5), тогда как градуировочный график электрода, содержащего мембрану (1), изготовленную согласно известному способу, нелинеен уже при концентрации 2,5 мМ.

Пример 3. Аналогично примеру 1 изготавливают ферментную мембрану для определения лактата. Для приготовления ферментного слоя 50 ед. лактатоксидазы растворяют; капле смеси сывороточного альбумина и глутарового альдегида в пропорциях как в примере 1 и выливают на ядерный фильтр, определяют ток электрода при рН 7,2.

Линейная зависимость градуировочного графика при испопьзовании ядерного фильтра наблюдается до концентрации лактата 10 мМ, в том время как в случае использования макропористой мембраны она сохраняется топьно до концентрации 1,5 мМ, Диапазон измеряемых концентраций расш, ряется е

6 раз.

Пример 4. Сравнительное определение глюк зы в кре и с использованием ферментно. мембраны, изготовленной пэ предложенн,му и известному способам.

Готовят фермеи а мембрану аналогично примеру,, наносят ее на электрод, измеряют ток пр нанесении на электрод кап-;и неразбавленной крови. Параллельно изготавливают ферментную мембрану по известному способу, измеряю ..к электрод- в

20-кратно раз =. ;енном о, зцс исс. е,пуемой I :ро,при помощи анализатсле ЭКСАН-Г}, установлены; е концентрации глюкозы приведены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, найденные концентрации практически совпадают.

Данные, приведенные в табл. 1 показывают, что при использовании ядерных фильтров, пористость которых

0,02-34, обеспечивается достижение цели, так как диапазон линейное и градуировочных графиков расширяется в 2-50 раэ, т ° е. концентрация определяемой глюкозы в растворе может составлять 4-100 мМ, вместо 1,9 мМ.

Наибольший диапазон линейности градуировочного графика наблюдается при использовании ядерного фильтра с пористостью 0,023, однако при этом чувствительность электрода уменьшается до 0,05 нА/мМ. Аналогичная взаимосвязь между диапазоном линейности и чувствительностью следует также из макрокинетического уравнения. Таким образом, оптимальными параметрами с практической точки зрения обладают мембраны, в которых используются ядерные фильтры с пористостью 0,05-33.

Они обладают линейностью в практически важном диапазоне концентрации глю535892 ь

2-50 раз (от 4 до 100 мМ вместо

1,9 мМ).

Бремя т лени я, 0,5 8 1О 12 13 15 20 25 30

0,02 0,03 0,05 0,1 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0

Пористо

Диапазо ного кали ного

50 35 25 20 15 10 5 4

0 19 0 35 1 0 1 65 2 5 5 12 5 20 чМ 100 чувс; pè теп,нос ь, нйlм 1 ), 05

Табл и ца 2

Ток электрода, нА, при концентрации этанола, мМ

Электрод

0,25 0,5 1 2 2,5 5 7,5 10 15 20 30 40

80 81 81 82 82 82 83

1,8 2,7 4 5,2 8 12 12

12 17,5 24 30 30 30 30

34 48 53,6 65 70 72 73

49 55 60 62 72 62 63

16 32 64 78

0,18 0,35 0,7 0,9

1,2 2,5 4,7 6

3,4 6,8 13 17

4,8 9,5 19 24

8,1

О,1

0,6 7

> /

2,5

П р и м е ч а н и е, Этанолчувствительные электроды исследованы при рН 8, содержат макропористую мембрану (1) или микропористые ядерные фильтры (2-5); время травления 10 мин (2), 15 мин (3), 20 мин (4) и 30 мин (5).

50 Таблица 3

Ферментная мембрана по способу

Концентрация глюкозы, мМ

4,3 5,1 4,5 8,3 3,0 4,7 16,2 12 0

4,1 4,9 4,8 8,4 3,1 4,8 16,0 12,4 предло.i<, ином; известному

П р и м е = н и е. Используют ядерный фильтр с пористостью 0,053.

5 1 козы и достаточной чувствительностью.

Механическая прочность ядерных фильтров до травления составляет

12,6-13,4 кг/мм и уменьшается до

9,3 кгlмм при травлении в течение

30 мин при 50 С и в 201-ном растворе щелочи. Таким образом, прочность предложенной мембраны с низкой пористостью больше, чем макропористой мембраны по известному, прочность которой меняется в пределах 7,59,1 кгlмм при изменении пористости г от 4,7 до 11,44.

Таким образом, г.рименение предложенного пособа позволяет улучшить качество целевого продукта за счет расширения диапазона измеряемь.х концентрации субст.атов шерментов B формула изобретения

Способ получения ферментных мембран, включающий связывание ферментов с лавсановой мембраной путем обработки глутаровым альдегидом в присутствии сывороточного альбумина, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта за счет расширения диапазона измеряемых-.концентраций субстратов ферментов, в качестве лавса- овой мембраны используют ядерные ф,.льтры с пористостью 0,02-3,0i, полученные из лавсановой пленки.

Таблица 1