Способ получения l-триптофана
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения незаменимой аминокислоты L-триптофана, которая может быть использована в питании человека и животных, производстве фармацевтических препаратов, для приготовления микробиологических диагностических сред. Целью изобретения является повышение качества целевого продукта за счет снижения концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости. Способ заключается в выращивании продуцирующего L-триптофан штамма BACILLUS SUBTILIS ВНИИгенетика-15 в условиях аэрирования в питательной среде, содержащей сахар, кукурузный экстракт, мочевину, минеральные соли и дезоксирибонуклеазу в концентрации 1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-8</SP>-1<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-7</SP> мг белка/мл среды, при этом после окончания процесса выращивания, о котором судят по понижению величины оптической плотности культуры, культуральную жидкость выдерживают в условиях пониженного аэрирования. Сочетание приемов введения ДНКаза с выдерживанием культуральной жидкости в режиме пониженного аэрирования приводит к понижению количества сопутствующих аминокислот (L-фенилаланина, L-тирозина и L-аланина) на фоне высокого уровня L-триптована. 1 табл.
союз соВетских социАлистичесних
И.:СПУБЛИН (51) 5 . 12 P 13/22
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21) 4268147/31-13 (22) 24,06.87 (46) 07.02.90. Бюл, ¹ 5 (71) Казанский химико-технологичес.— кий институт им. С,М, Кирова (72) О.А. Решетник, Д.Г. Победимский, Л,A. Музыченко и В.А, Сотников (53) 663.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1206305, кл ° С 12 Р 13/06, 1984.
Авторское свидетельство СССР
¹- 990814, кл. С 12 P 13/22, 1984. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-ТРИПТОФАНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения незаменимой аминокислоты L-триптофана, которая может быть использована в питании человека и
- животных, производстве фармацевтических препаратов, для приготовления микробиологических диагностических сред. Целью изобретения является повьппение качества целевого продукта
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения незаменимой аминокислоты L-триптофана, которая может быть использована в питании человека и животных, производства фармацевтических препаратов для приготовления микробиологических диагностических сред.
Цель изобретения — повышение качества целевого продукта за счет снижения концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости.
ÄÄSUÄÄ 1541257 А1 за счет снижения концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости. Способ заключается в выращивании продуцирующего L-триптофан штамма Bacillus subtilis. ВНИИгенетика-15 в условиях аэрирования в питательной среде, содержащей сахар, кукурузный экстракт, мочевину, минеральные соли и дезоксирибонуклеазу в концентрации 1«10 8 — 1 10 мг бел-7 ка/мл среды, при этом после окончания процесса выращивания, о котором судят по понижению величины оптической плотности культуры, культуральную жидкость выдерживают в условиях пониженного аэрирования. Сочетание приемов введения ДНКазы с выдерживанием культуральной жидкости в режиме пониженного аэрирования приводит к понижению количества сопутствующих аминокислот (L-фенилаланина, L-тирозина и L-аланина) на фоне высокого уровня L — триптофана. 1 табл.
Способ заключается в том, что штамм-продуцент L-триптофана Bacillus
subtilis ВНИИгенетика-15 культивируют в условиях аэрирования в питательной, среде, содержащей сахар в качестве источника углерода, кукурузный экстракт, мочевину, минеральные соли и дезоксирибонуклеазу (ДНКазу) в кон-. центрации 1«10 — 1 «10 мг белка/мл среды. После окончания процесса выращивания, о котором судят по понижению величины оптической плотности куль1541257
Концентрация ДНКавы, мг/мл среды
1,0 1О-
1,0«10 1
Время культивирования до выдервки, ч
Время вьдеркки, ч
Концентрация Ь-трнптофаиа, г/л
Суммарная концентрация сопутствующих аминокислот, в том числе: фенилалаиина тирозина аленина
48 г
52
2 4
8 О
7>05 7>00 7>00 7>00 7 ° 00 10>00 10>40 10>60 10>70 10 ° 70 7 ° 80
0,62 1,72
0,20 0,60
0,05 0,12
О,37 1,00
1,54
0,52
0,12
0,90
1, 54
0,50
О,11
0,93
1,83
0,50
О, 13
l,20
1,12 0,76
0,40 0,30
О, 08 0,06
0,64 0,40
0,60
О;2О
0,05
0>35
1,57
0,50
0,12
0,95
1,56
0,50
О,1 1
0,95
1,50
0,48
0,12
0,9О туры, культуральную жидкость выдержи- вают в течение 4-6 ч в условиях пониженного аэрирования. Использование
ДНКазы в определенной концентрации в сочетании с вьщерживанием культуральной жидкости в течение 4-6 ч в определенном режиме аэрирования приводит к понижению количества сопутствующих аминокислот (.-фенилаланина, 10
L"òèðîçèHà и L-аланина), которые накапливаются в культуральной жидкости параллельно с целевой аминокислотой ,L òðèïтофаном, Введение ДНКазы в концентрации ниже 1к10 в и выше 1 10 мг белка/мл среды не приводит к понижению концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости при выдерживании. Выдерживание в течение менее 20
:4 ч приводит к недостаточному понижению уровня сопутствующих аминокислот, а выдерживание в течение более 6 ч не меняет их уровня в культуральной жидкости. Результаты соответствующих эк спериментов суммированы в таблице, где поКазано влияние различных концентраций ДНКазы и времени выдержки культуральной жидкости на содержание сопутствующих аминокислот и L-трипто- 30 фана, Пример. Односуточную культуру
,штамма В. subtilis ВНИИгенетика-15 ,выращенную на косяках с arapoM Хоттингера, пересевают в колбы Зрленме ера емкостью 750 мл„содержащие 50 мл ,питательной среды следующего состава, %: сахар 5; кукурузный экстракт 2;
КНЕРО4 0,06; М2НРОФ 0,14; вода водопроводная остальное. рН среды доводят
40%-ным раствором NaOH до 7,4-7,6.
Колбы вместе со средой предварительно стерилизуют в автоклаве в течение
40 мин при 120-121 С. После засева колбы устанавливают на круговую ка" чалку (200-220 об/мин) и выращивают посевной материал в течение 20-24 ч при 37 С, Посевной материал вносят в количестве 8-10% (по объему) в лабораторный ферментер Bio-Flo модель СЗО емкостью l л, содержащий 500 мл ферментационной среды следующего состава, %: сахар 10; Х8$0,ь 7НоО О,1; NaCl
0,05; КН2РО+ 0,06; КоНРОа 0,14; кукурузный экстракт 2; мочевина О, 5; вода водопроводная остальное. рН среды доводят 40%-ным раствором NaÎH до 7,4-7,6, Ферментационную среду без мочевины стерилизуют аналогично описанному. Раствор мочевины готовят отдельно, стерилизуют в течение
40 мин при 110-112 С и задают в ферментер перед посевом.
Режим ферментации: температура культивирования 37+1 С; скорость врао щения мешалки 720 об/мин; аэрация
1 л/л мин, Одновременно с инокулятом в ферментационную среду вносят ДНКазу в количестве 1,0к10 " мг/мл. По окончании процесса ферментации, когда наблюдается падение величины оптической плотности микробной суспензии, культуральную жидкость выдерживают в течение б ч при 37 С, скорости вра41257 6
10
35
i,О 10-
1,О 10-
О (контроль) 52
8 О .2 4 6
790795795790710715705710700710705700710707
1,47 1,46
0,43 О ° 43 о,ii о,ii
0,93 0,82
l,46 1,46
0,43 0,43
0,1О О,il
0,93 0,92
1,46
0,42
0,11
0,93
1,46 1,45
0,44 0,45
0, ii О,10
0,91 0,90
1,35 1,33
0;46 0,44
0,09 0,09
О,8О 0,80
i,56
0,50 о,ii
0,95
l,34 1,34
0,38 0,40
О,О8 О,08
0,84 0,86
l,35 1,45
О,42 0,45
О,08 О,10
0,85 0,90
5 15 щения мешалки 720 об/миц и расходе воздуха О, I л/л-мин. Концентрацию
L-триптофана и сопутствующих аминокислот (алании, фенилаланин, тирозин) в культуральной жидкости определяют с помощью аминокислотного анализатора.
Контролем служит процесс без использования ДНКазы и выдержки в определенном режиме в течение 6 ч.
Добавление в среду культивирования ДНКазы в количестве 1,0 10 7 мг/мл с по следующей выде ржк ой к ул ьт ур ал ьной жидкости в течение 6 ч в режиме пониженного аэрирования ведет к снижению суммарной концентрации сопутствующих аминокислот с 1,47 г/л в контрольном варианте до 0 6 г/л в опытном. Концентрация фенилаланина в контрольном варианте составляет
0,43 г/л, а в опыте 0,20 г/л; концентрация тирозина снижена с 0,11 г/л (контроль) до 0,05 г/л (опыт); концентрация аланина — с 0,93 г/л (контроль) до 0,35 г/л (опыт). Выход целевого продукта — L-триптофана составляет при этом в опытном варианте
10,7 г/л.
Таким образом, внесение в среду культивирования фермента ДНКазы в концентрации 1, О к1 О 8 — 1, О «10 мг/мл с последующей выдержкой культуральной жидкости в течение 4-бч в режиме пониженного аэриров ания способствует уменьшению по сравнению с контролем концентраций сопутствующих аминокислот на 9-59Х при высоком выходе L50 50 52
2 4 6 8 О 2 4 6 триптофана. При изменении дозы вносимого стимулятора в условиях выдержки как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения не наблюдается снижения количества сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости по сравнению с контролем, Внесение различных концентраций ДНКазы без последующей выдержки культуральной жидкости в режиме пониженного аэрирования также не приводит к снижению концентраций сопутствующих аминокислот.
Формула изобретения
Способ получения Ь-триптофана, предусматривающий культивирование продуцирующего его штамма Bacillus
subtilis ВНИИгенетика-15 в условиях аэрирования в питательной среде, содержащей сахар, кукурузный экстракт, мочевину, воду и минеральные соли в виде фосфатов калия, сульфата магния, хлорида натрия, до максимального накопления биомассы с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения его качества за счет снижения концентрации сопутствующих аминокислот в культуральной жидкости, в питательную среду дополнительно вводят дезоксирибонуклеазу в количестве 1 «1Π†1 "!О мг белка/мл среды, при этом после окончания процесса выращивания культуральную жидкость выдерживают в течение 4-6 ч.
