Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментсодержащих препаратов для химического, клинического и токсикологического анализа. Цель изобретения - улучшение качества ферментсодержащих пленок за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличение срока годности пленок. Способ заключается в получении желатиновых пленок, содержащих моноаминоксидазу и обработанных глутаровым альдегидом, и инкубации полученных пленок в течение 40-50 мин раствором ингибитора-профлавина в концентрации 5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-4</SP>-8<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-3</SP>-1,5<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">-3</SP> М. Пленки могут быть использованы для совместного и раздельного определения разных моноаминов в биологических жидкостях. У пленок в 3 раза увеличивается срок годности, предел обнаружения моноаминов 10<SP POS="POST">-9</SP> М. 1 табл.

C0IO3 СОВЕТСНИХ

И Ф

РЕСПУБЛИН

{51) 5 С 12 N 11/10, 9/06

I г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ г

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР! (21) 4319058/28-!3 (22) 20.10.87 (46) 15.05.90. Бюл, ¹ 18 (71) Научно-производственное обьединение "Биолар" и Латвийский государственный университет им. П; Стучки (72) Д,Ю. Балцере, Б.А. Гринберг, А.А. Прикулис, Е.Б. Никольская, О..В. Ягодина и Г.К. Микелсоне

:(53) 577,15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1495378, кл. С 12 N 11/12, 27.07.87, Durand P. et а1. An enzyme electrode for acetylcholine. — Biophys., Biochim Acta,, )978, 527, р. 277-281. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ ПЛЕНОК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферИзобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментсодержащих препаратов для химического, клинического и токсикологического анализа.

Целью изобретения является улучшение качества ферментсодержащих пленок за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличения срока годности пленок.

Способ заключается во введении препарата моноаминоксидазы в буфер-.„ ный раствор желатина, нанесении полу ченного раствора на подложку, высушивание раствора на воздухе для получения пленки и ее обработки глутаровым альдегидом с последующей инку„.SU,„, 1564187 А1

2 ментсодержащих препаратов .для химического, клинического и токсикологического анализа. Цель изобретения— улучшение качества ферментсодержащих пленок за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличение срока годности пленок. Способ заключается в получении желатиновых пленок, содержащих моноаминоксидазу и обработанных глутаровым альдегидом, и инкубации полученных пленок в течение

40 — 50 мин раствором ингибитора-профлавина в концентрации 5 -10 4 — 8 х к10-41! или ! 0- - 1,5 О g. Пленки

l могут быть использованы для совместного и раздельного определения разных моноаминов в биологических жидкостях. У пленок в 3 раза увеличивается срок годности, предел обнаружения моноаминов 10 з М. 1 табл. бацией пленки в течение 40-50 мин в растворе ингибитора-профлавина в концентрации 5 10 ... 8 -!О М или 1 10 .. ° 1,5 10 М.

При обработке профлавином в концентрации 5 .1 О ...8 1 О М ингибируется активность моноаминоксидазы.В, катализирующую дезаминирование бензиламина. Такая пленка пригодна для избирательного определения тирамина .и серотонина, При концентрации проф лавина 1 ° 10 ° ..1,5-10 М ингибирует— ся моноаминоксидаза, дезаминирующая тирамин. Полученный препарат пригоден для определения серотонина.Совместное или раздельное использование ферментсодержащих пленок позволяет

1564187 более избирательно определять моноамины в биологических жидкостях. Срок годности пленок возрастает в 3 раза.

Пример 1. 0,5 т желатина помещают в стаканчик с 10 мл дистилли5 рованной воды для набухания. Затем туда же добавляют 1 0 мл О, 05 М фосфатного буфера, рН 7,4„ и нагревают

При переметивании до полного растворения желатина. Далее раствор охлажо дают до +25 С и вносят в него 2 r гомогената митохондрий печени свиньи или О, 01 г лиофилизированной моноаминоксидазы в 1 мл 0,05 M фосфатном буфере, рН 7,4, перемешивают ° Смесь порциями по 5 мл выливают на ровную поверхность полиэтиленовой пластинки и высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Сухую пленку желатина с включенной в ней моноаминоксидазой обрабатывают 10 мл 47.-ного раствора глутарового альдегида (ГА) в течение

3-5 мин. После этого избыток раствора ГА сливают, а пленку многократно 25 промывают водой и 0,05 M фосфатньж буфером, рН 7,4 и снова высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч (образец 1) . Далее одну сухую пленку обрабатывают 10 мл 7,6 10 моль/л раст- 30 вором профлавина в течение 45 мин, После обработки профлавином пленку высушивают в .потоке воздуха при

+15 С (образец 2).

Третью пленку, высушенную после обработки глутаровым альдегидом, обрабатывают 10 мл 1,3 10 моль/л раствором профлавина в течение 45 мин.

После обработки профлавином пленку о высушивают в потоке воздуха при 15 С 40 (образец 3) °

Ферментсодержащие пленки хранят в холодильнике при 4-10 С.

Результаты опытов приведены в таб лице. Все пленки получают аналогично ,примеру 1 за исключением концентрации ингибитора и продолжительности обработки, которые указаны в таблице.

Проверка полученных ферментсодержащих пленок проведена согласно приведенной методике.

Определение моноаминов в биологической жидкости.

Ферментсодержащий препарат — пленку с MAO активностью (образец 1)

55 помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда же 3, 5 мл О, 15 моль/л раствора

КС1 или NaC1 и 0,5 мл исследуемой крови человека .. Измерительньй сосуд закрывают, помещают в термостат при о

35 С, включают магнитную мешалку и

10 мин пропускают 0 без СО, . Далее поток 0 перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживают„30 мин при

35 С с интенсивным перемешиванием.

После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют

1,4 r КС1, охлаждают сосуд до 25 С, закрывают пробкой с рН стеклянным электродом, на поверхность которого помещена капля 0,27-ного раствора тритона Х- 305 (ПАВ) в бидистиллированной воде, снова пропускают 0 без

СОп и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 моль/л

Na0H (рН раствора 12) для полного освобождения NH, После установления постоянного потенциала (рН)(20 мин) на электроде записывают показания потенциометра (рН-метра). Находят по градуировочной прямой значение концентрации общих моноаминов (МА), соответствующее значению потенциала.

Для контроля содержания аммония в крови (фоновое содержание NH ) проводят описанный опыт только в реакционной смеси, вместо ферментсодержащей пленки с МАО активностью помещают контрольную желатиновую пленку без фермента.

Общее содержание моноаминов в кро-: ви рассчитывают как разность между общим количеством аммиака минус фоновое количество аммиака. Оно составляет 0,33 мкг/мл крови., Содержание тирамина и серотонина в модельной смеси.

Ферментсодержащий препарат — пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией б "

«10 моль/л (образец 2) помещают в сосуд для измерений электрода с газовым

-G зазором, pîáàâëÿ îò 0,32 мл 5 10 моль/л раствора серотонина, 0,24 мл 5 «

-ь

«10 моль/л раствора тирамина и

0,24 мл 5 10 моль/л раствора бензиламина. Туда же добавляют 3,2 мл Кфосфатного буфера, рН 7,6. Таким образом, концентрация в реакционной смеси: серотонина 4 .10 моль/л, тирамина — 3 10 моль/л, бензинамина—

3 10 моль/л.

Общая концентрация моноаминов в реакционной смеси 1 ° 10 моль/л, Измерительный сосуд закрывают., помещают в термостат при - 5 C, включа4187 d

45 После установления постоянного потенциала (рН) на электроде записывают показания рН-метра.

50 рамина и серотонина 0,26 мкг/мл крови, соответствующее значению потен,;желатиковую пленку с МАО активностью . обработанную профлавином с концент° рацией 8 ° 10" моль/л в течение 50 мин.

5 156 ют магнитную мешалку и 10 мин пропускают О беэ СО>. Далее поток О перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 45 С и интенсивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично примеру 1.

Находят по градуировочной прямой значение концентрации суммы серотонина и тирамина, т.е. 7 -10 7моль/л, соответствующее значению потенциала.

Определение серотонина в модельной смеси.

Ферментсодержащий-препарат — пленку с МА0 активностью, обработанную фосфатным буферным раствором профлавина с концентрацией ингибитора 1,3"

° 10 моль/л в течение 45 мин (обра-3 эец 8), помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда 0,32 мл 5 «

«10 моль/л раствора серотонина, О,?4 мл 5 ° 10 моль/л раствора тирами-1 на и 0,24 мл 5.10- моль/л раствора бензиламина. Туда же добавляют 3,2 мл

К-фосфатного буфера, рН 7,6. Концентрация в реакционной среде, моль/л:

-7 7 ° серотоник 4 10;тирамин 3 -10; бензиламин 3 10

Общая концентрация моноаминов в

-1 реакционной смеси 1 10 моль/л.

Измерительный сосуд закрывают, поо мещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О g без CO a.

Затем поток О перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживао ют 50 мин при 45 С и интенсивном перемешивании. Далее проводят аналогично примеру 1.

Находят по градуировочной прямой значение концентрации серотонина 3»

«10 моль/л, соответствующее значению потенциала.

Пример 2, Определение суммарного количества тирамина и серотони- на.

0,5 г келатина помещают в стаканчике с 10 мп дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 1О мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4, и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина.

Далее раствор охлаждают до +25 С и вносят в него 2 г гомогената.митохондрий печени свиньи в 1 мл 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,4, перемешивают. Смесь выливают на ровную по t0

40 верхность и высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Сухую пленку желатина с включенной в кей МАО обрабатывают 10 мл 4Х-ного раствора глу тарового альдегида в течение 5 мин, После этого избыток раствора альдегида сливают, а . пленку многократно промывают водой и 0,05 М фосфатным буфером» рН 7,4, и снова высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч.

Сухую желатиковую пленку с МАО активностью обрабатывают 10 мп раствора профлавина с концентрацией

5 10 моль/л в течение 40 мик. После обработки избыток раствора сливают, пленку промывают фосфатным буфером и высушивают в потоке воздуха.

Пленка пригодна для определения суммарного количества тирамина и серотонина в биологических жидкостях.

Пленку помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раство« ра КС1 и 0,5 мл исследуемой крови человека.

Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 40 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О 7 без СО7. Далее поток перекрывают и герметически закрытый соCO суд выдерживают 50 мин,при 40 С с интенсивным перемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 r

КС1, охлаждают сосуд до 25 С, закрывают пробкой с рН стеклякным электродом, ка поверхность которого помещена капля 0»2Х-ного раствора тритона Х-305 в бидистиллированной воде, снова пропускают 0< без СО и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 моль/л NaOH (рН 3 12). для полного освобождения аммиака.

По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации тициала.

Пример 3. Определение содержания тирамина и серотонина в крови ведут аналогично примеру 2, однако применяют ферментсодержащий препарат-- !

564187

По градуировочной прямой:находят суммарную концентрацию тирамина и серотонина 0,27 мкг/ил крови.

Пример 4. Получают желатиновую пленку с ИАО активноотью согласно примеру 2. Сухую пленку обрабатывают 10 мл фосфатного буферного раствора профлавина с концентрацией 4

«1О моль/л в течение 35 мин.

После обработки высушенную пленку проверяют для определения тирамина и серотонина в крови.

Инкубирование и определение аналогично примеру 2. Объем исследуемой крови также 0,5 мл. По градуировочной прямой находят значение концентрации моноаминов 0,30 мкг/мл, соответствующее значению потенциала.

В данном случае результат завышен из-за недостаточного ингибирования активных центров MAO ответственных за деэаминирование бензиламина и, следовательно, .определяется еще и

25 часть бензиламина.

Пример 6. Ферментсодержащий препарат — желатиновую пленку с ИАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1,3 10- моль/л в течение 40 мин, помещают в сосуд для измерений электрода с газовым, зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 мл/л раствора КС1 и 0 5 мл исследуемой крови человека.

Далее проводят все операции аналогично примеру 2.

55

Пример 5. В сосуд для измерений электрода с газовым зазором помещают ферментсодержащий препарат— желатиновую пленку с МАО активностью, 30 обработанную профлавином с концентрацией 9,5 .10 "моль/л. Добавляют 3,5 мл

0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 исследуемой крови, Инкубирование и оп-! ределение аналогично примеру 2.

По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации моноаминов 0 24 мкг/мл . В данном случае результат занижен, поскольку завышенная концентрация ингибитора час- 40 тично ингибировала уже активные центры ИАО, ответственные за дезаминирЬвание тирамина и, следовательно, определяется.все количество серотонина и только часть тиранина. Препа- 45 рат не пригоден для суммарного опре-, деления тирамина и серотонина.

Находят по градуировочной прямой значение концентрации серотонина . 0,15 мкг/мл.

Пример 7. Определение ведут аналогично примеру 2 с использованием желатиновой пленки, обработанной профлавином с концентрацией !,5

"10 моль/л.

Находят концентрацию серотонина

0,15 мкг/мл.

Пример 8. Определение ведут аналогично примеру 2 с использованием желатиновой пленки, обработанной . профлавином с концентрацией 1,4 « х10 моль/л в течение 50 мин.

Найденная концентрация серотонина 1,15 мкг/мл.

Пример 9. Ферментсодержащий препарат — пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 9,0 10 " моль/л в течение

60 мин, помещают в сосуд. Добавлявт 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0 5 мл исследуемой крови. Далее инкубирование и определение аналогично примеру 2, По градуировочной кривой находят значение концентрации моноамина

0,17 мкг/мл. В данном случае результат концентрации серотонина завы— шен, поскольку концентрация ингибитора профлавина была недостаточной для полного ингибирования активных центров МАО, дезаминирующих тирамин, и, следовательно, вместе с серотонином определяется еще часть тиранина, Пример 10.. Ферментсодержащий препарат — пленку с MAO активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1,6 ° 10 моль/л в течение

45 мин, помещают в сосуд, Добавляют

3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и

0,5 исследуемой крови. Далее инкубирование и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной кривой нахоцят значение концентрации моноамина

; 0,15 мкг/мл. Так же как в примерах 6. 8 определяется все количество серотонина. Следовательно, оптимальным препаратом для определения серотонина является пленка, обработанная препаратом профлавином с концентрацией

1 10 з- 1,5 .10 моль/л. Применение препарата, обработанного увеличенным количеством ингибитора, не требуется и является нецелесообраэным.

Ь )

Найденные в анализируемой смеси ма-. ноамины

Образецец

Введенные в анализируемую смесь моноамины, моль/л

Продолжит ельОбработка профлавином с концентрацией, моль/л ность обработки, мин

Тира- Серота- Бенэил- Суммарн, мин нин амин колич моль/л Состав

Беэ обработки профлавином

3 10 4")0

1 10 (Сумма рное с количество

3 !О

1 10 тирамэна, сератонина и бенэиламина

7,00 "10 7 Суммарное количество

3 )О

3 10 4 10 з

1 ° 10 >

6 10 4 тирамина и серотонина

6,95.10 Суммарное количество

1 10

3 )0 4 )0 7 3 )0

8 10-4

3, )О- 4>)0-

3 10-ч 4;)0 7 тирамина и сератонина

6,97 !О "

8>5 .10 7 Суммарное количество

3 10

3") 0

5 10

35 тирамина и серотонина, часть бенэиламина

5,8 10 (Общее количество серо.

3 10 4 10 )6 9 104

60 танина и

9 1564 I 8

Желатиновые пленки, обработанные профлавином, пригодны для многократного использования, поскольку профлавин является необратимым ингибитором MAO и в условиях использования пленок профлавин не вымывается в течение всего срока пригодности, кото-. рый лимитируется механической сохранностью пленки. Срок годности плен- 10 ки 4 мес (при проведении 5 определений ежедневно), В сухом виде при о

4-10 С - ферментативная активность пленки сохраняется в течение 9 мес.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить ферментсодержащие пленки, пригодные для определения моноаминов, с улучшенными характеристиками, а именно с увеличен= 20 ными избирательностью и сроками годности. В 3 раза увеличивается срок годности и возникает возмо;кность совместного и раздельного определения моноаминов в биологических жидкостях 25 без введенияв системудля определения

7 )O дополнительных количес". =. \н)ибитсрог моноаминоксидаз. Лрепар.>т обеспечивает предел обнаруже)п(я моноаминов до 10 М.

Формула изобретения

Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов, включающий введение препарата моноаминоксидазы в буферный раствор желатина, нанесение полученного раствора на подложку, высушивание раствора на воздухе для получения пленки и последующую обработку поверхности пленки глутаровым альдегидом, о т— л и ч а ю шийся тем, что„ с целью улучшения качества ферментсодержащих пленок .за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличение срока годности пленок, полученную пленку обрабатывают в течение 40-50 мин раствором ингибиторапрофлавина в концентрации 5 10 4...

8 IO 4 М или 1 !О ...1,5-)0 )).

12

Продолжение таблицы

1564187

Введенные в анализируемую смесь моноамины„ моль/л

Обра зец родолжительБензил- Суммарн; амин колич.

Тира- Сер отв мин нин

I моль/л Состав

7 1 ° 10 9 40

3 107 4 :. 3 10

8 1 3.10-з 45

9 1,5 10 50

10 1,7«10 60

Составитель В. Муромец

Редактор Т. Лазоренко Техред Л.Олийнык

Корректор M. Самборская

Заказ 1139 Тираж 484 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина, 101 бработка профлавиом с конентранией оль/л ность обработ ки, мин

3 101

310>

4 1О"

4 10

4 0-1

3 10

3 10

3 ° 10

1 ° 10

l O-c

1 il0 4

Найденные в анализируемой смеси моноамины

1 часть тирамнна . т

3,98.10 Только серотоннн

3,99 10 1

4,0 ° 10 1

3,99 ° 10

1,