Способ получения растений-регенерантов rauwolfia cenescens l. в культуре тканей

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения большого количества растений - регенерантов у ценного лекарственного растения Rau- wolfla canescensl. Цель изобретения - повышение выхода регенерантов. Способ состоит в том, что осуществляют двухэтапное культивирование листовых эксплантантов на модифицированных средах Мурасиге-Скуга с последующим микрочеренкованием и размножением полученных из каллусной ткани побегов. Способ позволяет получить большое количество регенерантов за короткий срок. 4 табл.

Изобретение относится к биотехнологии выращивания растений и может быть использовано для ускоренного массового размножения, оздоровления и селекции ценных экземпляров растений, имеющих народнохозяйственное значение, а также в исследованиях по генетике и морфогенезу. Цель изобретения увеличение выхода регенерантов. Способ состоит в том, что молодые листья культивируемых растений payвольфии седоватой стерилизуют и помещают на питательную среду для образования культуры ткани следующего состава, мг/л: калия нитрат 3600,0-4000,0; аммония нитрат 1200,0-1800,0; кальция хлорид 80,0-120.0; магния сульфат 100,0-120,0; калия дигидрофосфат 160,0-200,0; аrap 5500,0-6500,0; сахароза 24000,0-30000,0; инозит 80,0-120,0; тиамин 6,0-10,0; пиридоксин 0,8-1,2; никотиновая кислота 0,8-1,2; аскорбиновая кислота 1,0-3,0; глутамин 15,0-25,0; микроэлементы по прописи Мурасиге и Скуга; α - нафтилуксусная кислота 1,8 3,0; 6-бензиламинопурин 1,8-2,0. После образования культуры ткани отбирают плотные каллусы ярко-зеленого цвета, пересаживают их на питательную среду для индукции побегов, содержащую, мг/л: минеральные соли, микроэлементы, сахарозу, инозит по прописи Мурасиге и Скуга, агар 5500,0-6000,0; глутамин 15,0-25,0; тиамин 5,0-10,0; пиридоксин 1,0; 1,5; аскорбиновая кислота 2,0-3,0; никотиновая кислота 1,0-1,5; 6-бензиламинопурин 1,5-2,5, и развившиеся побеги размножают микрочеренками. П р и м е р 1. Молодые листья культивируемых растений раувольфии седоватой моют мылом, промывают водой и стерилизуют в 10%-ном растворе хлорной извести в течение З мин. После 2-кратного промывания в стерильной воде листья разрезают на фрагменты 0,5х 0,5 см, делают насечки по всей поверхности листовой пластинки и помещают во флаконы с 10 мл питательной среды для каллусообразования следующего состава, мг/л: калия нитрат 3600,0; аммония нитрат 1200,0; кальция хлорид 80,0; магния сульфат 100,0; калия дигидрофосфат 100,0; агар 5500,0; сахароза 24000,0; инозит 80,0; тиамин 6,0; пиридоксин 0,8; никотиновая кислота 2,0; аскорбиновая кислота 1,0; глутамин 15,0; микроэлементы по 2 прописи Мурасигеи Скуга; (a-нафтилуксусная кислота 1,8; 6-бензиламинопурин 1,8. При использовании питательных сред другого состава также наблюдают образование культуры ткани, однако образующийся тип каллуса не способен к морфогенезу при пересадке на среду для индукции побегов. Эксплантаты инкубируют в течение 35-40 дней при 16-часовом фотопериоде (освещенность 1,0-3,0 тыс. лк) и 28^oС. При культивировании менее 35 дней каллусы еще недостаточно оформлены, а при культивировании более 40 дней выход плотных ярко-зеленых каллусов снижается, так как начинается некротизация тканей. Развившиеся каллусы в зависимости от плотНасти и цвета можно разделить на несколько типов, указанных в табл. 3. Отбирают плотные каллусы ярко-зеленого цвета и пересаживают их во флаконы с 10 мл питательной среды для индукции побегов следующего состава, мг/л: минеральные соли, микроэлементы, сахароза и инозит по прописи Мурасиге и Скуга, агар 5500,0-6000,0; глутамин 15,0-25,0; тиамин 5,0-10,0; пуридоксин 1,0-1,5; аскорбиновая кислота 2,0-3,0; никотиновая кислота 1,0-1,5, 6-бензиламинопурин 1,5-2,5. Выбор питательной среды для индукции побегов обосновывается данными табл. 2. Через 35 дней развиваются побеги (более 6 шт. на 1 эксплантат) длиной более 3,5 см с 2-3 узлами и с 6-8 почками. Более длительная инкубация не приводит к увеличению числа побегов (табл. 4). Пересадка каллусов других морфологических типов либо не приводит к образованию побегов, либо эти каллусы в процессе пересадок теряют свою регенерационную способность (табл. 1). В конце каждого пассажа агрегат, состоящий из каллуса, побегов и почек, извлекают из культуральных сосудов и побеги расчленяют на микрочеренки размером 1,0-1,5 cm с 1-2 узлами, а каллус с почками делят на фрагменты размером 0,8x0,8 см. Эксплантаты пересаживают на свежую питательную среду для индукции побегов указанного состава, где к 35-му дню культивирования микрочеренки и фрагменты каллуса с почками образовывают по 4-7 побегов на 1 эксплантат. Дальнейшее размножение проводят путем микрочеренкования образующихся побегов и посадки их и фрагментов каллуса с почками на свежую питательную среду. После получения необходимого числа побегов их укореняют и переносят в почву. Полученные растения-регенеранты здоровые и морфологически не отличаются от исходных растений. П р и м е р 2. Подготовленные к культивированию in vitro, как указано в примере 1,20 молодых листочков раувольфии седоватой помещают во флаконы с питательной средой следующего состава, мг/л: калия нитрат 3800,0; аммония нитрат 1500,0; кальция хлорид 100,0; магния сульфат 110,0; калия дигидрофосфат 11,0; агар 6000,0; сахароза 27000,0; инозит 100,0; тиамин 8,0; пиридоксин 1,0; никотиновая кислота 1.0; аскорбиновая кислота 2,0; глутамин 20,0; микроэлементы по прописи Мурасиге и Скуга; a- нафтилуксусная кислота 2,4; 6-бензиламинопурин 1,9. Состав среды обоснован данными, представленными в табл.1. В процессе инкубации более 90% эксплантатов образуют каллусы, из которых на 37-й день культивирования отбирают 48 (24% от общего числа плотных каллусов ярко-зеленого цветам и пересаживают на питательную среду для инкубации побегов, как указано в примере. Результаты исследований по подбору состава питательных сред представлены в табл. 1 и 2. Использование изобретения позволяет ускоренно размножать ценное лекарственное растение раувольфию седоватую. Весь процесс от получения каллуса до растений-регенерантов занимает в среднем 3 месяца, причем способность плотного ярко-зеленого каллуса к образованию побегов сохраняется в течение длительного срока субкультивирования. Выход растений на один каллус составляет около 5000 растений за 5 месяцев культивирования. Одновременно растения освобождаются от бактериальной, грибной и вирусной инфекции. В селекционно-семеноводческой работе с раувольфией этот способ позволяет значительно сократить выведение новых сортов. ТТТ1

Формула изобретения

Способ получения растений-регенерантов Rauwolfia cenescens L. в культуре тканей, включающий посадку стерильных эксплантатов на питательную среду для каллусообразования, получение каллуса, перенос его на среду для индукции побегов с последующим культивированием до получения растений-регенерантов, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода регенерантов, получение каллуса осуществляют на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга при следующем соотношении компонентов, мг/л: Калия нитрат 3600,0 4000,0 Аммония нитрат 1200,0 1800,0 Кальция хлорид 80,0 120,0 Магния сульфат 100,0 120,0 Калия дигидрофосфат 100,0 120,0 Агар 5500,0 6500,0 Сахароза 24000,0 30000,0 Инозит 80,0 120,0
Тиамин 6,0 10,0
Пиридоксин 0,8 1,2
Никотиновая кислота 0,8 1,2
Аскорбиновая кислота 1,0 3,0
Глутамин 15,0 25,0
Микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга:
Альфа-нафтилуксусная кислота 1,8 3,0
6-Бензиламинопурин 1,8 2,0
Вода дистиллированная До 1 л
а индукцию побегов проводят на модифицированной среде Мурасиге-Скуга при следующем соотношении компонентов, мг/л:
Минеральные соли, микроэлементы, сахароза, инозит По прописи Мурасиге-Скуга
Агар 5500 6500
Глутамин 15,0 30,0
Тиамин 5,0 15,0
Пиридоксин 1,0 2,0
Аскорбиновая кислота 2,0 4,0
Никотиновая кислота 1,0 2,0
6-Бензиламинопурин 1,5 2,5
Вода дистиллированная До 1 л

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3