Способ идентификации лектинов

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биохимии растений, и может быть использовано в биохимии иммунитета растений и патогенам и в медицинской биохимии для идентификации компонентов лектинов в спектрах белков. Целью изобретения является упрощение и повышение разрешающей способности анализа. Для этого перед фракционированием подбирают оптимальный состав реплики, на поверхности которой могут иммобилизоваться лектины, и после фракционирования на разделяющий гель накладывают реплику, с которой лектины связываются, после чего реплику погружают в раствор эритроцитов и по ярко-красным полосам идентифицируют лектины.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вi)g )$:,»)Qg

i.,: -ниии

) F yQ — ——

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4472456/30-13 (22) 04.08,88 (46) 15.06.90. Бюл. N. 22 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений (72) А.В.Конарев (53) 575.633.112.1 (088.8) (56) Peumans W.J. etal. à genetic basis for. the

origin of six different isolectins in hexaploid

wheat. — Planta, 1982, ч. 154, р. 562. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛЕКТИ

НОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биохимии растений, и

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биохимии растений и животных, и может быть использовано в области биохимии иммунитета растений к патогенам и в медицинской биохимии для идентификации компонентов лектинов в спектрах белков после электрофореза, изоэлектрического фокусирования или фракционирования белков другими методами.

Лектины — это белки, специфично связывающиеся с определенными углеводными группами, которые могут входить в состав гликопротеинов слюны или крови животных, яичного белка и т.д. Важную биологическую роль играют углеводные остатки, находящиеся на поверхности клеток — эритроцитов, спор патогенных грибов и т.д. Лектины благодаря своим свойствам участвуют в реакциях "узнавания" в морфогенезе и в защитных реакциях животных и растений.

„„Я „„1571070 А1 (si)s С 12 Q 1/40, А 01 Н 1/04, G 01 N 33/00

1 может быть использовано в биохимии,иммунитета растений к патогенам и в медицинской биохимии для идентификации компонентов лектинов в спектрах белков.

Целью изобретения является упрощение и повышение разрешающей способности анализа. Для этого перед фракционированием подбирают оптимальный состав реплики, на поверхности которой могут иммобилизоваться лектины, и после фракционирования на разделяющий гель накладывают реплику, с которой лектины связываются, после чего реплику погружают в раствор эритроцитов и по ярко-красным полосам идентифицируют лектины.

Целью изобретения является упрощение и повышение разрешающей способности анализа.

Способ состоит в том, что перед фракционированием неочищенных белков предварительно устанавливают состав реплики, оптимальный для связывания определяемых лектинов, а после фракционирования белки из разделяющего геля переносят на реплику, с которой лектины связываются, затем реплику погружают в суспензию эритроцитов и идентифицируют лектины на реплике по ярко-красным полосам, образованным эритроцитами.

Суть метода заключается в следующем.

Лектины связываются с репликой либо за счет специфичного взаимодействия с включенными в состав реплики гликопротеинами, или углеводами, остатки которых соответствуют специфичности лектинов, либо за счет неспецифичного взаимодействия с матери1571070

15 алами реплики, например с нитроцеллюлозой. Молекулы лектинов, фиксированные на поверхности реплики, способны соединяться с углеводными остатками мембран эритроцитов своими свободными реакционными центрами. Фиксация лектинов на реплике позволяет им достаточно прочно удерживать эритроциты, что, например, дает воэможность даже прополаскивать реплику в физиологическом растворе для уменьшения фона от неспецифичности осевших зритроцитов. При отсутствии такой фиксации механически стабильных спектров агглютинировавших эритроцитов получить практически невозможно или по крайней мере очень трудно, Пример 1. Идентификация компонентов агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) в спектрах белков зародышей после изофокусирования.

Зародыши отделяют от зерна пшеницы сорта Безостая 1. Навеску из 100 мг зародышей, размолотых вступке,,заливают 1 мл 0,1

НС!, Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают.

Для выбора оптимального для определяемого лектина состава реплики готовят несколько типов реплик; ПААГ, обработанный мукопротеинами слюны; ПААГ, обработанный каким-либо другим типом гликопротеинов; нитроцеллюлозная мембрана, обработанная каким-либо гликопротеином; гель (акриламидный, агарозный или другой), в состав которого включены определенныее углеводн ые группы; необработанная нитроцеллюлозная мембрана и т.д.

На поверхность реплики наносят каплями по 2-10 мкл изучаемый раствор белков, содержащий лектины, Через 10-20 мин реплики промывают физраствором и помещают в суспензию эритроцитов, При оптимальных для изучаемого лектина условиях осуществления способа на месте нанесения образца появляется ярко-красное пятно. B случае АЗП оптимальной является реплика, состоящая из ПААГ, содержащего мукопротеины слюны и обработанного глутаровым альдегидом для связывания мукопротеинов с ПААГ.

Проводят изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) белков в 6%-ном ПААГ толщиной 0,2 мм, содержащем 2% амфолина с интервалом рН. 3-10. Образцы наносят на гель с помощью полосок фильтровальной бумаги в объеме 1-20 мкл. Полимериэуют

6%-ную ПААГ-реплику толщиной 0,2 мм на пластиковой подложке. Реплика содержит

0,9% NaCI в фосфатном буфере рН 7,5. Реплику обрабатывают в течение минуты мукопротеинами слюны человека. Затем

55 реплику накладывают на 40 мин на бумагу, смоченную 10%-ным глутаровым альдегидом. Реплику ополаскивают в физрастворе

5-10 мин и слегка подсушивают для удаления капель влаги. После ИЭФ на разделяющий гель накладывают гель-реплику на

10-30 мин. Затем реплику погружают в суспензию (1-4% по объему) эритроцитов кролика. Через 5-20 мин на поверхности гель-реплики появляются четкие ярко-красные полосы, образованные эритроцитами, связанными с лектинами, На разделяющий гель после реплики накладывают фотопленку на 20 мин и проявляют ее трипсином для идентификации компонентов ингибиторов трипсина. Изоточки лектинов и ингибиторов трипсина из зародышей пшеницы несколько отличаются.

Таким образом, предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет идентифицировать в спектре белков компоненты лектинов и наличие примесей белков с иной специфичностью не влияет на результаты.

Пример 2. Идентификация компонентов лектина фасоли.

Выбор оптимального варианта реплики проводят, как в примере 1, Для лектина фасоли наиболее оптимальной репликой является необработанная нитроцеллюлозная мембрана, Проводят ИЭФ препарата лектина фасоли. На разделяющий гель накладывают необработанную нитроцеллюлозную мембрану. После переноса белков за счет диффузии (10-20 мин) мембрану погружают в суспензию эритроцитов. Компоненты лектинов фасоли проявляются в виде ярко-красных полос. В этих же условиях АЗП выявляются очень слабо, т.е. чувствительность данного варианта способа достаточна для лектина фасоли и недостаточна для

АЗП, Использование предлагаемого способа обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества.

Повышение достоверности и разрешающей способности анализа при идентификации компонентов лектинов. Компоненты лектинов выявляются непосредственно на реплике с разделяющего геля и примесь других белков не влияет иа результаты.

С одного геля можно снять несколько реплик, обработанных разными гликопротеинами или углеводами для идентификации разных типов лектинов; желатиновые реплики для идентификации ингибиторов протеиназ, реплики, содержащие субстраты для идентификации различных ферменов и их ингибиторов и т,п.

1571070

Составитель В.Демкин

Редактор О.Спесивых Техред М.Моргентал Корректор Н.Ревская

Заказ 1487 Тираж 513. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101

Упрощение и повышение производительности анализа, сокращение его и родолжительности, Отпадает необходимость очистки лектинов. На одном геле можно одновременно анализировать 20-30 образцов суммарных экстрактов белков, содержащих лектины, Идентификацию компонентов лектинов можно провести за 20-30 мин после

ИЭФ.

Формула изобретения

Способ идентификации лектинов, включающий фракционирование белков в гелях, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения разрешающей способности анализа, перед фракционированием белков предварительно подбирают состав реплики, оптимальный для связыва5 ния определяемых лектинов, а после фракционирования белки из разделяющего геля переносят на реплику, с которой лектины связываются, затем реплику погружают в суспензию эритроцитов и идентифицируют

10 лектины на реплике по ярко-красным полосам, образованным эритроцитами, причем фракционированию подвергают неочищенные белки,