Способ получения моноспецифических антисывороток

 

Изобретение относится к молеку- , лярвой биологии, иммунохимии, медицинеи может быть использовано для эффективной иь1му11иэаг 1и людей и животных , а также для получения высокоактивных моиоспецифических сывороток Цель изобретения - повьппение актив™ ности целевого продукта с одновременним снижением количества антигена} используемого для иммунизации. Для этого моноспецифические антисыноротки получают комбинированной им fyнliзaциeй животных-продуцентов индивидуальными бeлкa fи - антигенами, вьщелепиыми электрофоретически, сначала в растворе в смеси с адч.ювантом Фрейнда, а затем - I) составе измельченного полиакриламидного геля. Способ позволяет получать высокотитражные антксьгоор зтки, исходя и:) л ЬО мкг индивидуального белка-антигена. G ®

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУЬЛИН

ÄÄ SUÄÄ 1587724

А1 (51)5 А 61 К 39/285

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И А BTOPCHG5Nf СВИДЕ 1 ЕЛЬСТВУ

7 . ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (46) 15.05.91. Бюл. Р 18 ! (21) 4472621/14 (22) 08.08.88 (7?1 Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии

Минмедбиопрома (,72) А.И.? ?уравлев и С. С.Рекетников (53) 612.015 (088,8) (56) Pedersen С.Е,, Eddy J.A., Separation, isolation and irmnunological

studies of the structural proteins

of venezuelan Equine encephalomyelitis vizus. — J. Virol., 1974, v. 14, п.: 4, 740-744. (54) СПОСОБ ПОИУЧЕКИЯ МОИОСПЕЦИФИЧЕСКНХ AHTHCbIHOPOTOK (57) Изобретение относится к молеку-, лярной биологии, иммунохимии, медицине и может быть использовано для эфИзобретение относится к медицине и биологии, а именно к иммунохимии, молекулярной биологии идиагностике инфекций, Способы получения моноспеци@ических антисывороток к индивидуальным полипептидам входящим в состав сложных белковых смесей, включают в себя два независимыхэтапа. На первом этапе с помощью определенного набора биохимических процедур выделяют исследуемый индивидуальный белок, На вто,ром этапе выделенным белком"анти геном иммунизируют животных-продуцентов.

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта, с:одновременным снижением количества

2 фективной иммунизации людей и животных, а также для получения высокоактивных моноспецифическкх сывороток.

Цель изобретения — повьппение активности целевого продукта с одновременным снижением количества актигека; используемого для иммунизации. Для этого мокоспеиифические актисыворотки получают комбинированной иммунизацией животных-продуцентов индивидуальными белками - актигеками, выделе гкыми электрофоретичсски, сначала в растворе в смеси с адъювактом Фрейкда, а затем — в составе измельченного полиакриламидкого геля, Способ позволяет получать высокотитражкые актисыворртки, исходя из 50 мкг икдивидуаль- Е ного белка-актигека. актигека, используемого для имиукизации.

Это достигается комбинированной иммунизацией животных-продуцентов раствором белка-антигека в смеси с адъювантом Фрейнда, а затем — в составе измельченного полиакриламидного геля, что позволяет получать высокотитражкые актисыворотки, исходя из ! очень малых количеств актигека.

Способ осуществляют следующим образом.

Сложную смесь белков подвергают . электрофоретическому разделению в полиакриламидком геле в присутствии

0 1%-ного ЦЦС-Na. После окончания электрофореза для удаления ЩС-Na гель выдерживают в 20 объемах 50%«но1587724

3 о (об/об) водного раствора этанола, рокрашивают в О, 1Х.-ной водной суспензии Кумасси ярко-синего К-250 и отмывают фон 10/-ным (об/об) водным раствором этанола. Окрашенную зону исследуемого белка вырезают, гель

Измельчают н отмывают от связанного с белком красителя 50Х-ным водным растором этанола. Элюацию белка из геля роводят свободной диффузией в буфее, содержащем 2Х. ДЦС-Na и 5Х р-мераптоэтанола, в течение 48 ч. После этого частички геля и водную фазу азделяют и диализуют по отдельности (ротив физиологического раствора.

1/2 часть элюата смешивают с ра|зным ,объемом полного адъюванта Фрейнда и вводят подкожно кроликам. Через

14 дн. кроликов повторно иммуни:зиру,ют подкожно оставшейся частью элюата

|в смеси с неполным адъювантом Фрейн,да, Через 14 дн. после второй иммунизации кроликам вводят подкожно из мельченный полиакрилаиидный гель с оставшимся в нем некоторым количеством белка-антигена. Через неделю после третьей иммунизации у животных берут кровь, иэ которой стандартныи способом получают иммунную сыворотку. 30

If р и м е р. Получение моноспецифических антисывороток к структурным белкам оболочки вируса осповакцины.

2 иг вируса оспонакцины (ВОВ) ресуспендиронали в 1 ил буфера (0,01 И трис-НС1, рН 9,0, 0,5Х NP-40), инкуо бировали 30 мин при 37 С и центрифугировали 30 иин при 30000g, Супернатант обозначили, как NP-40-фракцию.

Аналогично получали 2-меркаптоэтанол фракцию обработкой вируса 0,02 M 2иеркаптозтанолои. Оеадок представляет собой сердцевину НОВ. Электрофореэ проводили в 15Х-ном полиакрилаиидном геле в прерывистой буферной системе в присутствии О, 1Х

2 мин на кипящей водяной бане. Элект- 50 рофорез белков. проводили в двух пластинах 15/-ного полиакриламидного геля (с соотношением мономерон 100: I), размером 120х100х1,5 мм в прерывистой буферной системе Лэммли, при напряжении 100В и течение 6 ч.

После окончания злектрофореза пластины гелей вымачивали 2 ч в 0,5 л

50/-ного водного раствора этанола для удаления Щ С-Na и переносили в 0,5 л

1/-ной водной суспензии. Кумасси ярко-синего R-250 на 1 ч. Фоновое окрашинание отмывали в двух сменах по

0,5 л 10/-ного водного раствора этанола в течение 2 ч при постоянном покачивании.

Окрашенные зоны белков р35 в случае NP-40 фракции, р35 и р67 н случае 2-меркаптоэтанол-фракции вырезали из геля и тщательно измельчали в фарфоровой ступке. К образцам измель-,ченного геля добавляли по 30 мл

50Х-ного водного раствора этанола, инкубировали смесь н течение 10 мин с перемешиванием для удаления из геля красителя. Частички осаждали центрифугированием взвеси при 10 000g в течение 10 иин при комнатной температуре. К осадкам измельченного геля добавляли по 3 объема элюирующего буфера (2/ К!С-Na, 5/ 2-меркаптоэтанола, 0,01 И трис-НС1, рН 9,0), прогревали взвесь н течение 3 мин при 100 С и инкубиронали 48 ч при постоянном перемешивании на качалке при коинатной температуре, После этого частичкам геля давали свободно осесть в течение 1 ч, надосадочную жидкость собирали и диализонали против трех смен по 1 л физиологического раствора в течение 24 ч сначала при 20 (", а затем — при 4 С.

Полонину отдиализованного препарата, содержащего элюированный из геля белок, смешивали с равным объемом полного адъюнанта Фрейнда до образонания однородной эмульсии и вводили кроликам подкожно в область лопаток. Через

14 дн. вторую половину элюата смешивали с равным объемом неполного адъю,нанта Фрейнда и повторно подкожно иимунизировали кроликов. Через 7 дн. после второй иммунизации у кроликов забирали кровь иэ краевой ушной вены и стандартным способом получали из нее сыворотку.

Измельченный полиакриламидный гель с оставшейся н неи после элюации частью белков диализовали против трех смен по 1 л буфера (0,0 1 М трис-НС1, рК 9,0) в течение 48 ч сначала при

20 С, а затем — при 4 С, смешивали его после этого с равным объемом того же буфера н через 14 дн. после нторой иммунизации вводили его кроли.кам подкожно н область лопаток. Через

724

30 иократного введения осадка беэ адъю1 нанта.

5 158 7

7 дн. после третьей иммуниэацйи у животных забирали кровь и получали иэ нее сыворотку, Активность иммунных сывороток (антисывороток) оценивали методом раДиоиммуноанализа с 1 J)-меченым белком А иэ St,aureus на твердом носителе (полистирольные планшеты), В качестве контроля использовали нормальные сыворотки, полученные ct соответствуничих животных эа 5 дн, до первой иммунизации. Титром антисыворотки считали максимальное ее разведение, при котором в реакции радиоимму- 1g ноанализа наблюдалось еще 2-3-кратное превышение уровня включения Jрадиоактивности над уровнем включения контрольной (неиммунной) сыворотки.

Сыворотки, полученные от живот- Ж ных после второй иммунизации только в случае белка р35 из NP-40-фракции, показывали достоверное превышение .над фоном в реакции радиоиммуноаналиэа в разведении t/50, 25

После третьей иммунизации белками в составе измельченного полиакриламидного геля титр всех трех антисывороток резко возрос и составил

1(1000-1) 10000, что соответствует титру 1(128-1)256 н реакции радиальной иммунодиффузии.

Специфичность антисынороток проверяли методом радиоиммуноблотинга, используя суммарные вирусные белки, разделенные электрофоретически н

35 . 15%-ном полиакриламидном геле, с последующиМ переносом их на нитроцеллюлозный фильтр и выявлением комплексон антиген-антитело J J )-меченым гм

40 белком А из St,aureus авторадиографией.

Для получения моноспецифических антисывороток по предлагаемому спосо.бу.потребовалось по 20, 70 мкг каж- 45 дого из индивидуальных белков, Для получения же моноспецифических антисывороток описанными в литературе способами требуется более

0,5 кг белка-антигена, при этом активность получаемьх антисынороток значительно ниже активности антисынороток, полученных предлагаемым способом.Положительный эффект предлагаемого способа по сравнению с прототипом заключается н сиижении дозы антигена, необхоДимого для иммунизации, более чем в 1О раэ при одновременном увеличении титра антител и целеном

Jlpo;..:÷ êòå.

Технико-экономические преимущест. на предлагаемого способа заключаются н значительном сокращении объема работ по получению целевого продукта, поскольку для накопления необходимого для иммунизации количества белка-антигена, во-первых, требуется н 10-20 раз меньше исходного препарата белков, во-вторых, достаточно проведения одного цикла препаратинного электрофореэа„

Предлагаемый способ может быть рекомендован для стносительно быстрого, простого и эффективного получения маноспецифических антисывороток высоким титром про fHH индивидуальных белков-антигенов, входящих н состав слож-. ньм смесей, при их общем содержании

0,03-0,06 мг. формул а иэобретения

Способ иолу.- ения моноспецифических антисьи ороток путем электрофоретического выделения аитигена иэ общей массы белков в виде полоски голиакриламндного геля, измельчения, иммунизации. животных посредством мно- гократногс введения им порций размельченного геля, содержа цих антиген и адъювант фрейида, с последующим забором крсви у иммунизированных животных, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, с одновременным снижением количества антигена, исполь-. зуемого для иммунизации, после измельчения полоски геля обрабатывают вначале водным раствором этанола, затем — трис-НС1 буферным раствором, рН 9,0, содержащим додецилсульфат натрия, 2-меркаптоэтанол, инкубируют о вначале в течение 3 мин при 100 С и затем — в течение 48 ч при комнатной температуре, суспензию р зделяют на элюат, осадок размельченного геля и каждую часть диализуют против физиологического раствора, а иммунизацию животньм осуществляют комбиниронанно путем двукратного введения км. элюата н смеси с адъювантом чрейнда и од