Способ получения пептидов

 

Изобретение касается пептидов, в частности получения пептидов общей формулы N<SP POS="POST"> </SP>@ CH<SB POS="POST">3</SB>-TYR-ALA-ASP-ALA-ILE-PHE-THR-R<SB POS="POST">8</SB>-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU-R<SB POS="POST">15</SB>-GLN-LEU-SER-ALA-ARG-R<SB POS="POST">21</SB>-LEU-LEU-GLN-ASP-ILE-NLE-R<SB POS="POST">28</SB>-ARGNH<SB POS="POST">2</SB>, где R<SB POS="POST">8</SB> - LYS, ASP

R<SB POS="POST">15</SB> - GLY, ALA

R<SB POS="POST">21</SB> - LYS, D-LYS

R<SB POS="POST">28</SB> - ASN, SER, способствующих выделению гипофизом гормона роста, что может быть использовано в медицине и ветеринарии. Цель - создание новых более активных и менее токсичных веществ указанного класса. Синтез пептидов ведут связыванием С-конечной защищенной аминокислоты BOC-ARG-TOS с полимером-носителем : МБГА. Затем отщепляют аминозащитную группу и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидилполимера формулы X<SB POS="POST">1</SB>-N<SP POS="POST"> </SP>@ -CH<SB POS="POST">3</SB>-TYR(X<SB POS="POST">2</SB>)-ALA-ASP(X<SB POS="POST">3</SB>)-ALA-ILE-PHE-THR(X<SB POS="POST">4</SB>)-R<SB POS="POST">8</SB>(X<SB POS="POST">3</SB> или X<SB POS="POST">7</SB>)-SER(X<SB POS="POST">4</SB>)-TYR(X<SB POS="POST">2</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-LYS(X<SB POS="POST">7</SB>)-VAL-LEU-R<SB POS="POST">15</SB>-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-LEU-SER(X<SB POS="POST">4</SB>)-ALA-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-R<SB POS="POST">21</SB>(X<SB POS="POST">7</SB>)-LEU-LEU-GLN(X<SB POS="POST">5</SB>)-ASP(X<SB POS="POST">3</SB>)-ILE-NLE-R<SB POS="POST">28</SB>(X<SB POS="POST">4</SB> или X<SB POS="POST">5</SB>)-ARG(X<SB POS="POST">6</SB>)-X<SB POS="POST">8</SB>, где X<SB POS="POST">1</SB> - H, BOC - трет-бутилоксикарбонил

X<SB POS="POST">2</SB> - H, ДСВ - 2,6-дихлорбензил

X<SB POS="POST">3</SB> - H, OBRL - бензиловый эфир

X<SB POS="POST">4</SB> - H, BZL - бензил

X<SB POS="POST">5</SB> - H, XAN - ксантил

X<SB POS="POST">6</SB> - H, TOS - тозил

X<SB POS="POST">7</SB> - H, 2-CL-Z - 2-хлорбензилоксикарбонил и X<SB POS="POST">8</SB> - смола-носитель (МБГА - N-метилбензгидриламиновая смола). Затем отщепляют защитные группы и пептид от смолы-носителя с помощью трифторуксусной кислоты в дихлорметане и/или с помощью HF и поглотителя, предпочтительно анизола или метилэтилсульфида или их смеси, при 0 - (-20)°С и реакционную смесь растворяют в подходящем растворителе, предпочтительно в уксусной кислоте. Целевой продукт чистят и выделяют в виде основания. Испытания показывают более высокую активность новых пептидов, чем синтетического пептида HGRF(1-40)OH, и большее время действия. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И О ВСКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4355674/23-04 (22) 16,05.88

-(31) 053235 (32) 22.05.87 (33) US (46) 07. 10. 90. Бюл. P.- 37 (71) Дзе Солк Институт фор Биолоджикал Стадиз (US)

1 (72) Джин Эдуард Фредерик Ривьер (СН), Вили Волкар Вейл-младший (US) ! и Катран Лаура Ривьер (СН) (53) 547.964.4.07 ° 088 (088.8) (56) Патент ClllA N - 4292313, кл. А 61 К 37/00, опублик. 1981.

Шредер Э., Любке К. Пептиды, ч. I. — M. Мир, 1967, с. 116, 398, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности получения пептидов общей

И ф-лы N -СН -Tyr-Ala-Asp-Аlа-Ile-Pheз

-Thr-R -Ser-Tyr-Arg-Lys-Ual-Leu-R—

S 5

-Gln-Leu-Ser-Аlа-Arg-R -Leu-Leu-Gln21

-Asp-Пе-Nle-К -Агре, где R <—

Lys, Asp; R, — Gly, Аlа; R Lys, D-Lys; R — Asn, Ser, способствующих выделению гипофизом гормона роста, что может быть использовано в медицине и ветеринарии. Цель — создание новых более активных и менее токсичных веществ указанного класса. Синтез пептидов ведут связыванием С-конечной защищенной аминокислоты Вос Arg-Tos с полимером-носителем МБГА. Затем

Изобретение относится к способу получения пептидов — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине и ветеринарии.

„„SU;„1598881 А 3 (51)5 С 07 К 7/10 А 61 К 37/02

2 отщепляют аминозащитную группу и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом до образования пептидилполимера ф-лы X 1 = N -СН--Tyr(X ) Ala-Asp(Xs) -Ala-Пе-Phe-Thr(Х )-R< (Х > или Х,) -Ser (X Q -Tyr (X ) -Arg (X< )-Lys (Х ) -Ual-Leu-R, -С1п (Х -) -Leu-Ser (Х ) -Alà-Ага (Х q) -Rq (X ) -Leu-Leu. -Gln (X ) Asp (X ) -Il e-Nle-К (Х, или

Х )-Arg(XS) Х, где Х, — Н, Вос— трет-бутилоксикарбонил Х вЂ” H, ДС — 2,6-дихлорбензил; X> — Н, - 0Bz1 — бенэиловый эфир; Х вЂ” Н, Bzl— бензил, Х - Н, Хап — ксантил; Х <—

Н; Tos - тозил; Х вЂ” Н; 2-Сl-Z

2-хлорбензилоксикарбонил и Х вЂ” смоl ла-носитель (МБГА — п-метилбензгидриламиновая смола) . Затем отщепляют защитные группы и пептид от смолыносителя с помощью туифторуксусной кислоты в дихлорметане и/или с помощью НГ и поглотителя, предпочтительно анизола или метилэтилсульфида или их смеси, при 0-(-20) С и реакционную смесь растворяют в подходящем . растворителе, предпочтительно в уксусной кислоте. Целевой продукт чистят и выделяют в виде основания. Испытания показывают более высокую активность новых пептидов, чем синтетического пептида hGRF(1-40)0H, и большее время действия. 1 табл.

Цель изобретения — получение химическим путем новых пептидов, способствующих выделению гормона роста гипофизом, более активных, малотоксичных и более доступных соединений.

1598881

Время смешивания, мин 40

607 TFA/21 этандитиол

60 TFA/2 этандитиол

IPA/17 этандитиол

Et>N (107) в СН С1

МеОН

К,М (107) в СН Cl

МеОН (дважды)

СН С1 (дважды), 10

45

0,5

0 5

0,5

0 5

0,5 „

0,5

Связывания предпочтительно осуще55 ствлять согласно графику В. ,График В . Время смешиРеагент вания, мин

DCC1

Синтез пептидов осуществляют с помощью твердофаэного способа.

В тексте описания использованы следующие сокращения; МБГА — n-метилбензгидриламиновая смола OBzl

5 бензил; Xan — ксантил; Tos - тоэил;

2-Сl-Z — 2-хлорбензилоксикарбонил;

ДС — 2,6-дихлорбенэил, Z — бензилоксикарбонил; Вос — тре; .бутилоксикарбонил; НОВ Т вЂ” 1-оксибензтриаэол;

DMF — диметилформамид; TFA — трифторуксусная кислота.

Пример 1. Синтез пептида (ФМе Tyr,Asp A1à,Nle Asn hGRF (1-29) -МН формулы: N Me Tyr-Ala-Asp-Ala-П е-Phe-Tyr-Asp-Ser-Tyr-Ar g-1.у s - Ча 1-L eu-Al a-Gl n-L eu- Se r-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Пе-Nle Asn-Arg-NH осуществляют стадий2 20 но в пептидном синтезаторе Beckman 990 на смоле МБГН. Связывание

Boc-Arg (Tos) с указанной смолой приводит к замещению примерно

0,35 ммоль Arg на 1 г смолы, исходная смола взята в количестве 2 r, После деблокирования и нейтрализации пептидную цепь ступенчато наращивают на указанной смоле. Все используемые растворители тщательно дегазируют путем барботирования

30 инертным газом, например гелием или азотом, для гарантии отсутствия кислорода, который может привести к не-: желательному окислению серы Met-остатка. 35

Деблокирование в предпочтительном варианте осуществляют по графику А:

График А

Реагент

15,0

0,5

0,5 можно частично или полностью удалить под действием TFA, используемого для деблокирования альфа-аминозащитной группы. Получено 6,2 г пептидной смолы

Вос-аминокислота 50-90

МеОН (дважды) 0,5

CH CI (дважды) 0,5

Ас О (ЗМ) в

СН Сl

СН,С1

МеОН

СН Cl (дважды) 0,5

От 1 до 2 ммоль Вос-защищенной аминокислоты в хлористом метилене используют на 1 r смолы вместе с

1 экв. 1,0 молярного раствора DCC1 в хлористом метилене в течение 2 ч.

При связывании Вос-Arg (Tos). используют смесь из 507. РМР и хлористого метилена. Бензиловый эфир используют в качестве гидроксильной защитной группы боковой цепи для

Ser u Tyr. Аминогруппу Аэп или Gln блокируют Хап (ксантином), когда .используют DCC-связывание как предпочтительное. Сложный пара-нитрофениловый эфир (ONp) можно также использовать для активации карбоксильного компонента Asn или Gln и, например, Вос-Asn (ONp) можно связывать в течение ночи, используя 1 экв. 1-оксибензотриазола в 507. смеси из диметилформамида и метиленхлорида, в этом случае .N,N äèöèêëoãåêñèëêaðáoäèèìèä (DCC) не прибавляют. 2-хлорбензилоксикарбонил/ЗС1-Z/ используют в качестве защитной группы Lys боковой цепи, Тоз используют для блокирования гуанидиновой функции Arg и имидазольного азота His, a OBzl защищает боковую гидроксильную группу Gln или

Arg. Фенольный гидроксил Tyr защища-, ет 2,6-дихлорбензилом (DCB). В конце синтеза получают пептидил-полимер следующего состава: Вос-N MeTyr(X )-Ala-Asp(Х>)-Ala-Пе-Phe-Thr(Х )—

-Asp(X3)-Бег(Х,)-Tyr(X )-Аг8(Х<)—

-Lys(Х )-Val-Leu-Аlа-Gln(X<) -Leu-Бег(Х )-Ala-Arg(X<)-Lys(Х )-Leu-Leu-Gln(X )-Asp(X )-Ile-N1e-Asn(X )5 3 5

-Arg (Х ) -Х g, где Х означает РСВ; Х z — OBzl; Х --

Хап; Х вЂ” Tos; Х, - 2Cl-Z u X > — носитель или NH-МБГА-смола. Ксантин

159888 1

Для отщепления и деблокирования комплекса защищенный пептидил-полимер производят обработку смесью, содержащей 1,5 мл анизола, 0,5 л метиленсульфида и 15 мл фтороводоро- да (НР) на 1 г пептид-смолы при а (-20) С в течение 0,5 ч и 0 С еще

0,5 ч. После удаления HF под высоким давлением оставшийся на смоле пептид поочередно промывают сухим диэтиловым эфиром и хлороформом, а затем пептид экстрагируют дегазированным

2 н,водным раствором уксусной кислоты и отделяют от смолы фильтрованием.

Отщепленный и деблокированный пептид (3,1 r) затем растворяют в

0,57.-ном растворе уксусной кислоты и подвергают очистке, которая может включать гель-фильтрацию на сефадексе С-50.

Полученный пептид затем дополнительно очищают препаративной и полупрепаративной ВЭЖХ на хроматографе

HPLC преп.500 с использованием патрона 15-20pC — 18 в TEAP-2-25 /СН СИ— системе.. Собственные фракции отстаивают и затем чистят на том же самом патроне в TEAP-6,5 /CH CN-системе. ,Пригодные фракции отстаивают и чистят от соли на том же патроне в летучей системе 17 TFA/CH CN

Чистота на HPLC 99,9Х для

15 фракций.

Чистота на HPLC 9157 - 99,6Х для

16 фракций.

Основную фракцию отбирают, лиофилизуют, получают целевой продукт с выходом О, 95 г (22, 67), (a gв, -—

54,83 (С = 1,17.-ная уксусная кислота) .

Аминокислотный состав полученного пептида: Asp 4, 14; Thr 0,98; Ser

1,78; Gln 2,00; Ala 4,00; Val 0,93;

СН Туг 0,78; Ile 1,77; Leu 3,96;

Nle 0,96; Tyr 0,96; Phe 0,86; Lys

1,80, Arg 2,96.

Пример 2. Синтез пептида: (ФМеТуг,Lys 8 Ala,Nle,Asn + . hG12F(1-20) NH g формулы:

N NeTyr-Аlа Asp-Ala-Пе-Phe-Tyr0(-Lys-Se r-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Аlа-Сlп-Leu-Se r-Al à-Arg — 1.у s Leu-Leu ln-Asp-I1e-Nle-Asn -ArgNH .

Указанный пептид синтезируют в условиях примера 1 с использованием . тех же защитных групп, растворителей и активирующих агентов через образования пептидил-полимера.

Пептидил-полимер (4,6 г) обрабатывают с помощью НР в присутствии п-крезола, во время отщепления темпе о

5 ратуру поддерживают при 0 С в течение 1 ч. Отщепленный пептид подвергают лиофилизации, получают 2,6 r пептида. Полученный продукт чистят на хроматографе HPL С преп. 500, патрон 15-20 рС-!8 в системе TEAP-2,25

/СН СИ. Фракции, содержащие пептид, собирают на том же патроне в системе

TEAP-6,5/CH CN. Обессоливание проводят на том же патроне в системе ле15 тучее 17 TFA/СНзСИ.

Чистота на HPLC 99,9Х для 15фракций.

Чистота на HPLC 99,47. для i16 фракций.

Выход 0,86 r пептида (337.) И3в=

= -60,55 (С = 1, 17-ная уксусная кислота) .

Аминокислотный состав: Asp 3,07;

Thr 0,94; Ser 1,80; Glu 2,01; Аlа 4,С;

25 Val 0,97, СН Tyr 0,82; Ile 1,76;

Leu 3,93; Nle 0,97; Tyr 0,93; Phe

0,85; Lys 2,78; Arg 3, t5.

Пример 3. Синтез пептида:

PN МеТуг,DLys,Nle JhGRF(1-29)NH

30 формулы:

ФМеТуг-Ala-Asp Ala-.Ile-Phe-Thr-Asp-Бег-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln— . -Leu-Ser-Ala-Arg-М.уs-Leu-Leu-С1п-Asp.-Ile — Nle-Ser-ArgNH<.

Указанный пептид синтезируют в условиях примера 1. Образующийся промежуточный продукт — пептидил-полимер (1,5 г). Обрабатывают НР в присутствии п-крезола, во время от40 щепления температуру поддерживают о на 0 С в течение 1 ч.

Получают пептид в количестве

0,9 r, его чистят на хроматографе

HPLC при 500 с использованием набив45 ки 15-20 С-18 Vydac в системе

TEAP/СН СИ. Фракции, содержащие целевой продукт, отстаивают и обессолиьают на той же набивке в системе 17

РА/СНзCN.

Чистота на HPLC 96,7Х для

15 фракций, выход 0,061 г (6, 17)

fg 3 = -53,31 (С = 1, 17-ная уксусная. кислота).

Аминокислотный состав: Asp 2,98;

Thr 0,89; Ser 2,84, Gln 2,09-, Gly

1,00 Ala 2,89; Val 0,88; СН Туг

0,98; Пе 1,76; Leu 4,10; Nle 1„22;

Tyr 0,97; Phe 0,85; Lys 1,9 1;

Arg 3,01.

1598881

Проведены биологические Испытания полученных предлагаемым способом пептидов.

Сравнение проведено с синтетическим производным фактора высвобож5 дения инсулина человека pGRF /1-40/он в опьггах in vitro. При проведении испытаний использованы культуры, содержащие клетки гипофиза крысы, выделенные предварительно за 3-4 ч до проведения испытаний, Такие кле-. точные культуры являются оптимальными для определения секреции гормона роста и их используют в сравнительном испытании по общей методике Vale.

Инкубацию с испытуемым веществом проводят в течение 3-4 ч, после чего аликвотнйе количества культуральной среды выделяют и очищают для определения их содержания в иммунореактивном гормоне роста (irGH), используя традиционный радиоиммунный анализ.

В таблице приведены полученные данные сопоставительного испытания зквимолярных концентраций.

Пептид

Срав итель 30 ные данные

hGRF(1-40)-ОН (стандарт во время испытания) (Х 14еТуг Asp,Ala, Nle,Asn JhGRF (1-29)—

NH (N "MeTyr,Lys,Ala, .Nle,Asn 3ЬСКГ(1-29), ПЬ

$N Me Tyr, D-Ly s

И1е ИСКР(1-29)-NH

100 .

192 .

556 .

172

В дополнение к опытам in vitro, 45 проводимым для определения секреции гормона роста, в экспериментах in

vivo указанные синтегические пептиды вводят внутривенно в наркозированные уретаном мужские особи крыс.

Установлено, что они подавляют спон.танную.секрецию гормона роста, не препятствуя реакции на экзогенный

GRF. Пробы крови берут непосредственно перед введением и через 10, 30 и 60 мин после инъекции указанных 55 пептидов, и измеряют содержание гормона роста в крови радиоиммуноанализом. П, лученные данные испытания указанных синтетических пептидов in

v1vo - показывают, что каждое иэ них проявляет более высокую биологическую активность по сравнению с синтетическим пептидом pGRF (1-40)-ОН, Предлагаемые аналоги фактора выделения ростового гормона роста (GRF) имеют гораздо большую продолжительность действия, что подтверждается уровнями в крови гипофизарного гормона роста при измерении их как через 30, так и 60 мин после IV инъекций. Считают, что дозировка в интервале примерно 500 нг - 50 мкг укаэанных пептидов на 1 кг массы тела является эффективной для стимуляции секции гормона роста.

Проведенные испытания показали, что полученные предлагаемым способом пептиды, относясь, как и аналог—

hGRF (1-40)ОН, к соединениям малотоксичным, обладают более высокой (в 1,7-5,5 раз) способностью ускорять высвобождения ростового гормона под действием гипофиза в опытах in

vitro. Испытания в условиях in vivo показали, что эти соединения проявляют более высокую биологическую активность по сравнению с синтетическим пептидом hGRF(1-40)ОН. Кроме то

ro они имеют большую продолжительность действия и более доступны, так как имеют цепь на 11 аминокислотных остатков короче.

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы а

N feTyr-Ala Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R >-Ser-Tyr-Arg-Ly s-Val-Leu-R, -Сlп-Leu-Ser-Ala-Агя-К,;1.еи-Leu-Gln-Asp- u е-Nl e-R -Ar gNH <, где RS — Lys, Asp

R, — Gly, Ala

К,- Lys, DLys, . К - Asn-Ser LS

t отличающийся тем, чтосоответствующую С-конечную защищенную аминокислоту Вос-Arg-Tos связывают с полимером-носителем МБГА, аминозащитную группу отщепляют и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в соответствии с целевым пептидом

pо образования пептидил-полимера общей формулы

X - N MeTyr(Xq)-Ala-Азр(Х )—

-Ala-Ile-Phe-Thr-(ХФ) ЕВ(Хз или Х )—

-Ser(X )-Туг(Х ) -Arg (X <) -Lys(X ) -Val-Leu-RzgG1n(Х > -Leu-Ser(Х ) -Alа — ..

Составитель В.Волкова

Техред JI.0ëèHíûê Корректор Т. Палий

Редактор А.Шандор

Заказ 3077 Тираж 317 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г..ужгород, ул. Гагарина, 101

Агя (X с) В 1(Х ) -Leu-LeuWln(X<)—

-А ар (X> ) -П е-М1 е-R g> (Х или Х )—

-Arg(X<) -Х, где Х вЂ” водород или Вос, Х вЂ” водород или DCBX - водород или ОВг1;

Х вЂ” водород или Bzlg водород или Хап

Х вЂ” водород или Tos;

Х вЂ” водород или 2-С1-2, Х вЂ” сь»ола-носитель, 1598881

10 с последующим отщеплением защитных групп и пептида от смолы-носителя с помощью трифторуксусной кислоты в дихлорметане и/или путем применения

5, HF поглотителя, предпочтительно аниэола, или метилзтилсульфида, или их смеси при 0...(-20) С, реакционную смесь растворяют в подходящем растворителе, предпочтительно уксусной кислоте, и целевой продукт чис-. тят и выделяют в виде основания.