Способ размножения винограда in viтrо

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается микроклонального размножения винограда. Целью изобретения является повышение входа безвирусного посадочного материала и ускорение процесса размножения. Способ состоит в том, что на модифицированную среду Мурасиге-Скуга высаживают меристемы, вычлененные из почек невызревших побегов. Затем получают побеги, обрабатывают их базальные концы βИУК, укореняют, проводят микрочеренкование, после чего адаптируют полученные растения к условиям открытого грунта. 2 з.п.ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51)5 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

f10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4354751/30-13 (22) 17. 11.87 (46) 23.10.90. Бюл. № 39 (71) Всероссийский научно-исследоваг. тельский институт виноградарства и виноделия им. Я.И.Потапенко (72) Н.П.Дорошенко и И.А.Кострикин (53) 578.085.23 (088.8) (56) Голодрига П.Я. и др. Технология ускоренного размножения сортов винограда с применением культуры изолированной ткани. — Сельскохозяйственная биология, 1983, ¹ 3, с.62-65. (54) СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА .

IN VITRO

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам размножения растений.

Цель изобретения — повышение вы( хода безвирусного посадочного материала и ускорение процесса .размножения..

Способ может быть использован в виноградарстве для ускоренного размножения и оздоровления перспективных сортов винограда, в исследованиях по фитопатологии и физиологии винограда, служит охране окружающей среды.

Способ состоит в том, что осуществляют стерилизацию исходного материала, получение из него эксплантатов, введение их в культуру на среде Мурасиге-Скуга, содержащей цитокинин б-бензиламинопурин, микроразмножение и ускорение полученных побегов на твердой питательной среде с последующей высадкой в теплицу .для адаптиро2 (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается микроклонального размножения винограда. Целью изобретения является повышение входа безвирусного посадочного материала и ускорение процесса размножения. Способ состоит в том что на модифицированную среду Мурасиге-Скуга высаживают меристемы, вычлененные из почек невызревших побегов. Затем получают побеги, обрабатывают их базальные концы р -ИУК, укореняют, проводят микрочеренкование, после чего адаптируют полученные растения .к условиям открытого грунта. 2 з.п.ф-лы. вания к нестерильным условиям, при этом в качестве исходного материала используют почки невызревших побегов, из которых вычленяют меристематическую верхушку, а культуру п vitro . . осуществляют в три этапа с промежуточной обработкой базальных концов полученных побегов Я -индолилуксусной кислотой В-ИУК, при этом укоренение на втором этапе осуществляют на модифицированной. среде без ростовых веществ и с уменьшенным содержанием макроэлементов.

Кроме того, введение эксплантатов в культуру осуществляют на среде Мурасиге-Скуга при содержании б-бензил-. аминопурина 0,1-0,2 мг/л. При этом адаптацию полученных растений к нестерильным условиям, проводят в пленочных теплицах на солнечном обогреве °

Пример 1. Способ осуществляют на сорте новой селекции Агат донской.

1601117

В конце сентября готовят невызр вшую часть основных и пасынковых п бегов. Побеги хранят во влажных о илках при 0 — 5 С в течение 2 мес. о

В начале декабря приступают к вычлен нию и культивированию эксплантатов.

Перед посевом исходный материал стер илизуют. Заготовленные побеги нарезают на одноглазковые черенки, тщат ельно отмывают в теплой мыльной вое (40-50 С), для чего используют о етское мыло. Затем промывают водороводной и дистиллированной водой, п омещают в стеклянный бокс и на 40 с аливают 70 -ным этиловым спиртом, затем на 30 мин 10Х-ным раствором ипохлорида кальция, который отмыват в течение 10 мин в трех-четырем орциях дистиллированной автоклавиованной воды. После этого в стерильном боксе под микроскопом МБС-9 при

5-кратном увеличении с помощью дис— изионных игл из почек вычленяют меистематические верхушки размером

0,17-0,25 мм (в зависимости от величины почек), состоящие из конуса нарастания и двух-трех листовых при. мордиев. Выделенные таким образом

100 эксплантатов сорта Агат донской помещают на питальную среду Мураси1 ,ге-Скуга следующего состава, мг-/л (классическая пропись): NH+NO q 1650; . KNO 1900; СаС1 ° 6HzO 440; М880, х х 7HzO. 370; KHzPO4 170; Н ВО 3 6,2; ! MnSO4 ° 4HzO 22,3; СоС1 6Н О 0,025;

Са804 5HzO 0,025; ZnSOq 7Н О 8,6;, Ма Мо04 2Н О 0,25; KI 0,83; Ре$0+ х х 7HzO 27,8; Na 3DTA 2HzO 37,3 и дополнительно мезо-инозит 100;;

1 ридоксин 0 2; тиамин 0,2, никотино вая кислота 0,5; 6-бензиламинопурин (БАП) 0,15; сахароза 37.; агар 7,5 г/л; рН среды перед автоклавированием 5,6.

Пробирки с высаженными эксплантатами .помещают в культуральную комнату при температур воздуха 25-27 С, фотопериоде 16 ч освещенности 5000 лк, относительной влажности воздуха 70757.

Через 5 нед из 100 высаженных эксплантатов у 60 отмечается развитие побегов до 8-10 мм длиной с четырьмя-пятью листочками. Так как образования корней у этих побегов не происходит, приступают к обработке базальных концов побегов раствором

-ИУК. В боксе в асептических условиях побеги достают из пробирок и помещают базальными .концами на часовые стекла, в которые наливают раствор -ИУК в концентрации 100 мг/л.

Через 20 ч побеги высаживают на моди5 фицированную среду Мурасиге-Скуга (второй состав), не содержащую ростовых веществ и с уменьшенным содержанием макроэлементов, мг/л: KNO

950; NH,NO>138; MgSO< 7H О 185; СаС1 х х 2Н20 166 КН РО468 мг/л. При этом

Ге -хелат и микроэлементы оставили по

Мурасиге-Скугу, мезоинозит 50 мг/л, пиридок;.ин 0,2 мг/л; сахароза 10 г/л; рН 5,6-6,0.

В течение месяца побеги укореняются и образуется 60 оздоровленных от вирусных заболеваний растений. После этого приступают к их микроразмножению. Обеззараживанию растений способствует небольшой размер эксплантатов, выделяемых из почек невызренших побегов 0,17-0,25 мм, Оздоровленные растения размножают черенкованием: развившиеся растения разрезают„ оставляя на каждом отрезке один лист и почку в его пазухе. Этот микрочеренок снова помещают в пробирку с модифицированной питательной средой второго состава, но в нее добавляют Р -ИУК в количестве 0,3 мг/л, Через 4 нед. укореняются 54 растения (процент укоренения составляет при этой концентрации Р -ИУК 90), через 2 нед приступают к микроразмножению растений. До

1 июня проведены три пассажа. Коэффициент составляет 1:480.

Перенос пробирочных укорененных растений в нестерильные условия осу40 ществляют, используя торфоперегнойные горшочки с субстратом из торфа, почвы и песка (1:1:1). С помощью пинцетов растения извлекают из пробирок, пропаласкивают корни в дистил45 лированной воде, высаживают, поливают водой и накрывают на 6 дн полиэтиленовой пленкой. Пленку приоткрывают на несколько часов в день, а затем снимают. В дельнейшем растения регулярно поливают и подкармливают смесью

Чеснокова, После того как происходит адаптация растений, появляются один — два новых листа, растения высаживают в пленочные теплицы на солнечном обо55 греве с неполностью контролируемыми условиями выращивания: параметры температуры, влажности; освещенности складывались и колебались в зависи1601117

40 мости от метеоусловий. Экстремальные условия исключают путем регулярных проветриваний и поливов. Таким образом, данные условия приближены к

5 естественным условиям среды произрастания полученного посадочного материала.

Пример 2. Способ осуществляют на сорте Восторг.

В начале октября готовят невызревшую часть основных и пасынковых побегов. Побеги хранят во влажных опилках при 0 — 5 С в течение 2 мес. В о середине декабря приступают к вычленению и культивированию эксплантатов.

Стерилизацию исходного материала осуществляют, как в предыдущем случае. В стерильном боксе под микроскопом МБС-9 вычленяют 100 верхушечных 20 меристем и помещают на среду Мурасиге-Скуга, которая отличается от среды, на которой культивируют Агат донской, содержанием БАП. 6-Бензиламинопурин вводят в среду в концентра- 25 ции О, 1 мг/л. Условия культивирования верхушечных меристем аналогичны условиям сорта Агат донской.

Через 6 нед из 100 высаженных меристем 50 развивают побеги 8-10 мм длиной с тремя-четырьмя листочками.

Базальные части этих побегов в асептических условиях обрабатывают раствором Р -ИУК в контентрации 101мг/л и высаживают на среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: KNO> 955; 35

NH NO> 140; MgSO ° 7Hz0 187; CaClz x х 2Н О 167; КН РО 69; Fe — хелат, микроэлементы, сахароза и рН оставались без изменения, а мезоинозит

5 1 мг/л, пиридоксин 0,2 1 мг/л.

В течение месяца 49 побегов укореняются и образуют оздоровленные растения. Через 2 нед приступают к их размножению путем микрочеренкования.

В дальнейшем технология размножения 45 идентична для всех сортов, за исключением -ИУК, концентрация которой в данном случае составляет 0,4 мг/л, а укореняемость микропобегов винограда .82,57.. Проведены три пассажа растений. Коэффициент размножения равен 1:330.

Пример 3. Способ осуществляют на сорте Русмол.

В конце октября готовят невызрев- 55 шую часть основных и пасынковых побегов и приступают к вычленению и культивированию эксплантатов. Стерилизацию исходного материала осуществляют как у сортов Агат донской и

Восторг. Также в стерильных условиях вычленяют 100 верхушечных меристем и помещают их на среду Мурасиге-Скуга, содержание БАП в которой составляют

0,2 мг/л.

Через 6 нед иэ 100 высаженных меристем развивается 66 побегов длиной

8-10 мм с четырьмя — пятью листочками. Базальные части этих побегов обрабатывают водным раствором /3-ИУК в концентрации 99 мг/л и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: KNO9 945;

NH NOq 135; МАМБО 7Н О 183; CaClz x х 2HzO 165; KHzPO 67; Fe-хелат, микроэлементы, сахароза и рН оставались без изменения, меэоиноэит 49 мг/л; пиридоксин О, 19 мг/л.

В течение месяца 60 побегов укореняются и образуют оздоровленные растения. Через 2 нед приступают к их микроразмножению по технологии, идентичной примеру 1, эа исключением р-ИУК, которую добавляют в питательную среду в концентрации 0,5 мг/л.

Укореняемость микрочеренков при этом составляет 75K, количество пассажей четыре, коэффициент размножения 1:

:2500.

Пример 4. Способ осуществляли на сорте Ромулюс.

В начале октября заготовили не-вызревшую часть основных и пасынковых побегов. Побеги хранили во влажных опилках 1 мес. Во второй декаде ноября приступили к вычленению и культивированию эксплантатов. Стерилизацию исходного материала проводили так же, как и в предыдущих опытах.

В асептических условиях под микроскопом вычленяют 100 верхушечных меристем и помещают на среду Мурасиге-Скуга с содержанием БАП 0,25 мл/л.

Через 5 нед из 100 высаженных меристем развивается 50 побегов длиной

8-10 мм с тремя — четырьмя листочками. Базальные части побегов обрабатывают водным раствором р-ИУК в концентрации 100 мг/л и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: KNO 950;

NH N0q 138; MgSO 7Н О 185; СаС1 х х 2Н О. 166; КН РО 68; Fe-хелат и микроэлементы оставались без изменения по Мурасиге-Скуга, мезоинозит 50; пиридоксин 0,2.

В течение месяца 50 побегов укореняются и образуют оздоровленные расте160111 Г

Составитель В.Демкин

Редактор Н.Яцола Техред М.Хоцанич Корректор С.Шевкун

Заказ 3246 Тираж 485 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r Ужгород, ул. Гагарина,101 ния, Через 2 нед приступают к их микроразмножению и адаптации по опи-! санной технологии с содержанием

Р-ИУК 0,3 мг/л, как и в примере 1. S

До 1 июня сделано три пассажа и коэффициент размножения составляет 1:400, Использование предлагаемого спосо- ба позволяет получить безвирусный посадочный материал в большом количест- 1О ве в ускоренный срок.

Формула и э о б р е т е н и я

1. Способ размножения винограда

in vitro, включающий стерилизацию исходного материала, вычленение эксплантатов,посадку их на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую б-бензиламинопурин, с последующим культивированием и дальнейшую высадку в теплицу для адаптации к условиям открытого грунта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода безвирусного посадочного матери- д ала и ускорения процесса размножения, в качестве исходного материала используют почки невызревших побегов, в качестве эксплантата — находящуюся в почке меристему, а культивирование осуществляют в три этапа, первым из которых является получение из эксплантатов побегов, вторым — укоренение полученных побегов и третьим — микроразмножение, при этом перед укоренением проводят обработку базальных концов побегов, полученных на первом этапе культивирования, Р -индолилуксусной кислотой, а укоренение осуществляют на безгормональной модифицированной среде Иурасиге-Скуга с уменьшенным вдвое содержанием макроэлементов и последующее микроразмножение осуществляют на той же питательной среде с добавлением Р-индолилуксусной кислоты.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью уменьшения сомаклональной изменчивости, на первом этапе культивирования в питательную среду вводят 6-бензиламинопурин в количестве 0,1-0,2 мг/л.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю шийся тем, что 8 -индолилуксусную кислоту для обработки базальных концов побегов используют в концентрации 99-101 мг/л.