Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами

 

Изобретение относится к медицине и касается способа стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами. Способ осуществляется добавлением к фактору некроза опухоли в концентрации 10<SP POS="POST">2</SP>-10<SP POS="POST">8</SP> Ед/мл альбумина человеческой сыворотки в количестве 10 мкг - 50 мг на 1 мл водного раствора указанного фактора. 3 табл.

QQIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (S1)S А 61 К 37/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3571944/28-14 (22) 05.04.83 (31) 57-129560 (32) 27.07.82 (33) JP (46) 07.11.90, Вюл, Р 41 (71) Асахи Касеи Когио Кабусики и Дайниппон фармасьютикал Ко., Лтд (1Р) (72) Хайими Сакамото, Такао Кийота и Хироси Хаяаси (ЗР) (53) 6 12,0 15(088.8) Изобретение относится к медицине и касается способа стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы кролика, индуцированного липополисахаридами.

Получение высокоочищенного фактора некроза опухоли.

Самкам кроликов, каждая из которых имеет массу от 2 до 3 кг, внутривенно вводили 75 мл клеток Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum, Nellcome Research Labr England), убитых формалином. Спустя 8 дней каждому из кроликов внутривенно вводили 100 мг эндотоксина (липополисахарид, полученный из E.coli 0,26:Вб)

От каждого кролика получали кровь пункцией сердца через 2 ч после иньекции эндотоксина и полученную таким образом кровь смешивали с неболыпим количеством гепарина. Эту кровь подSU, 16059И АЗ

2 (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ВЫСОКООЧИШЕННОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ИЗ

ПЛАЗК ИЛИ СЫВОРОТКИ КРОЛИКА, ИНДУЦИРОВАННОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДАМИ (57) Изобретение относится к медицине и касается способа стабилизации высокоочишенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, инцуцированного липополисахаридами. Способ осуществляется добавлением к фактору некроза опухоли в концентрации 10 -10б ед/мл альбумича человеческой сыворотки в количестве 10 мкг — 50 мг на 1 мл водного раствора указанного фактора. 3 табл. вергали центрифугированию в течение

15 мин нри скорости 3000 об/мин, В результате получена плазма, со ержащая некротический фактор опухоли, имеющий активность, равную 2500 ед/мл.

Полученную таким образом плазму или сыворотку (10 л), содержащую некротический фактор опухоли, разбавляли 5 л 0,03 М фосфатного буферного . раствора, рН 7,8. Разбавленную плазму вносили в колонку размером

10>42 см с DEAE-сефарозой CL-6В, Pharmacia Fine Chemicals АВ, Sweden, уравновешенную О,ОЗМ Ьос@атным буферным раствором, рН 7,8, содержащим 0,13 М хлористого натрия. Эту колонку промывали 2,5 л О,ОЗМ фосфатного буфер..ного раствора рН 7,8, содержащего

О, 13 М хлористого натрия, и сорбированный некротический фактор опухоли разбавляют раствором хлорида нат1б05914

Полученный таким образом раствор некротического фактора опухоли ппд— вергали повторному рехроматографированию на той же самой колонке

Sepharose S-200 с использованием того же самого буферного раствора и в результате был получен раствор некротического фактора некроза опухоли имеющий характерную активность, 9

6 равную 1, О 10 ед/мг белка, 55 рия при линейном изменении его концентрации в количестве. от 5 л 0,,03 М фосфатного GyAepa, рН 7,8; сопержащего 0,15 М хлористого натрия, до

5,0 л 0,03 М фосфатного буфера, имеющего рН 7,8, содержащего 0,03 М хлорида натрия, Фракции, обладающие активностью фактора некроза опухоли, сливали вместе, подвергали ди- 10 ализу в течение 12 ч с применением

0,03 М трис-НС1буфера, рН содержащего 0,13 M хлористого натрия.

Диализованный раствор некротического фактора опухоли подвергали 15 повторному хроматогpa(bH"ованию на колонке типа DFAE-Sepharose CL-бБ (размером 3 .30 см). уравновешенную

0,03 М трис-НС1 буфером, рН 7,2, содержащим О, 15 N хлорида натрия.

Адсорбированный некротический фактор опухоли подвергали элюированию при линейном изменении концентрации хлорида натрия, раствором, содержащим 500 мл уравновешиваюшего 25 буферного раствора, и 500 мл 0,03 М трис-НС1 буферным раствором, рН 7,8, содержащим 0,3 М хлорида натрия.

Полученный концентрат подвергали гель-фильтрации через колонку типа

БерЬ, rose S-200, размером 5Х100 см, фирмы "Pharmacia", уравновешенную с помощью 5 мМ фосфатного буферного раствора, рН 7,0, содержащим О, 15 М хлорида натрия. Элюирование осущест)5 вляли с помощью буферного уравновешива дщего раствора. Скорость подачи составила 80 мл/ч. Фракции с активностью некротического фактора опухоли сливали вместе и годвергали концентрированию посредством ультрафильтрации.

Полученный таким образом некроти— ческий фактор некроза опухоли характеризовался характерной активностью, равной 5,0 10 ед/мг белка и имел чистоту в 10000 раз более высокую, чем чистота плaçìû.

Пример 1. Некротический фактор некроза опухоли кроликов, обладающий характерной активностью, равной 5,0 10 6 ед/мл, полученный как указано выше, разбавляли 0,1 N фосфатным буферным раствором, рН 7,0, содержащим 0,(5 М хлорида натрия с получением в результате раствора некротического фактора опухоли с активностью 1200 ед/мл. К этому раствору некротического фактора опухоли добавляли альбумин человеческой сыворотки (USA) в количестве 0,1 мг/мл и 1,0 мг/мл USA— фракция альбумина человеческой сыворотки (СоЬы; фракция V), фирмы Sipmc

Сепг Compary.

Для каждого из полувоенных в результате растворов производилось определение остаточной активности по отношению к: образцам, соответственно подвергнутым хранению в течение о

2, 7 и 30 дней при 4 С, образцам, подвергнутым 1-му и 3-м циклам зао мораживания при -70 С и оттаиванию, образпам, подвергнутым замораживанию при -70 С, лиофилизации и хранению в течение 7 дней при 25 С. При проведении таких испытаний раствор некротического фактора опухоли, к которому не добавляли стабилизирующий агент, использовали как контрольный раствор. Что касается лиофилизованной композиции, то эту композицию подвергали растворению в стерильной дистиллированной воде и затем подвергали анализу для определения активности по некротическому фактору опухоли.

Остаточную активность определяли

in vitro u in vivo

In vivo активность фактора некроза опухоли определяли измерением цитотоксической активности против L-М клеток: в качестве емкостей для культур использовали 96-ячеечные микротитровальные пластины, клетки выращивали в минимальной среде Игла, содержащей прогретую фетальную сыворотку теленка. Образец некротического фактора опухоли объемом О, 1 мл последовательно разбавляли средой и

L-M суспензию клеток (О, 1 мл, 1<40 клеток) перемешивали в каждой из ячеек пластинок, пластинки выдерживали при 37 С в течение 48 ч в атмосфере с содержанием 57. двуокиси углерода. В конце периода выращива5 1605 .1 ния добавляли 207.-ный водный раствор глутарового альдегида (20 мл) для фиксации клеток. После фиксации пластины промывали дистиллированной водой, 5 высушивали и затем окрашивали клетки

0,057-ным красителем "11етилен голубой". Пластины тщательно промывали дистиллированной водой для удаления избыточного количества красителя и высушивали, Затем в каждую ячейку добавляли 0,2 мл 37-ной соляной кислоты для вымывания красителя из окрашенных клеток. Поглощение каждой ячейки измеряли при длине вол- 15 ны 665 нм с помощью прибора Titertek

Nactiobon фирмы Flow Laboratories

Inc. Поглощение является пропорциональным количеству видимых клеток

Активность некротического фактора опухоли, выраженная B единицах на миллиметр, измеряли, как обратную величину разведения некротического фактора опухоли, которая вызывает

50Х-ную цитотоксичность и которую

25 можно выразить графически между разбавлением и поглощением. In vitro остаточную активность определяли в процечтах и рассчитывали по экспериментальным данным и в соответствии 30 со следующим уравнением:

Формула изобретения

Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из

А

Остаточная активность = — х/од

В

У где A — активность по некротическому фактору опухоли образца после хранения или физической обработки,  — активность образца по некротическому фактору опухоли перед хранением или физической обработкой.

В соответствии с методом in vivo каждый образец раствора подвергали концентрированию с получением концентраций, которые в 20 раз выше, чем первоначальные.

Далее 0,5 мл каждого из полученных таким образом конпентрированных растворов некротического фактора опухоли вводили инъекцией в хвостовую вену, каждой из мышей с опухолью, разбитых на группы по 5 мышей. Лктивность некротического фактора опухоли анализировали спустя 24 ч в соответствии с критериями, укаэанными в табл, 1, где (-) — нет изменений (+)— незначительный геморагический некроз, 14 6 (2++) — умеренный геморагический некроз (центральный некроз, охватывающий примерно 507 поверхности опухоли); (+++) — эначительнья геморагический некроз (массовый некроэ), Пример 2. Пекротическнй фактор опухоли, имеющий характерную акти;..ность, равную 1,0<10 ед/мг, полученныи в соответств:и с описанньп.и ранее, подвергали разбавлению с помощью 0,1 И фосфатного раствора, имеюшего величину водородного показателя, равную 7 ед. рВ и содержаще;-о 0,15 И хлорида натрия. В результате были получены растворы некротическаго фактора опухоли, соответственно имеющие активности по некротиР ческе"„ у фак-ору опухоли, равные 1 10, 1 к10, 1 >10, 1 10, 1i106, 1 >10 и

1x?С ед/мл. К элпквотным долям кажQ доге пз приготовленных таким образом раство".ов прсизводилось добавление

УЕЛ в таком количестве, чтобы обеспечить получение в результате раствора, имеющего концентрацию, равную

1,0 мг/мл. Каждый из полученных таким образом растворов некротического фактора опухоли подвергали хранению в ь те :ение 7 дней при 4 С и затем производился анализ этих растворов на aK— тивность некротического фактора опухоли в соответствии с методом in vitro.

Остаточная ж,тивность по некроти- - ческому фактору опухоли била рассчитана по той же методике, что и в примере 1. В качестве контрольной была взята другая аликвотная доля каждого из растворов некроти ".еского фактора опухоли, в который не вводили ЦБЛ, и эти контрольные аликвотные доли также подвергали анализу на определение активности некротического фактора.

Полученные результаты представлены в табл. 2.Стабилизирующий эффеь-т различных концентраций USA при концентрации факz тора некроза опухоли 1,2 10 ед/мл представлен в табл.3.

Из результатов табл.3 следует, что стабилизирующий эффект на активность- фактора некроза опухоли выявлен в концентрации от 10 до

50000 мкг/мл раствора фактора.

1605914 центрации 10 -10 ед/мл, альбумина человеческой сыворотки в количестве 10 мкг — 50 мг на 1 мл водного плаамы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами, путем добавления к водному раствору, содержащему уклаанньп фактор в кон«6» а раствора.

Таблица

Хранение при 25 С (лиофилинированная компоэицин) Хранение при 4 С (раствор) ьный пенеиием или кой обработЗамораживание, оттаивание

ja vitro, дни п viva, дни

in vitro, дни з

in vitro, 1п чача, 1п vivo дни дни

2 7 30

52 26 4 +3 -2 30 8

40 +4

100 +++4, ++1

102 95 80 +++3 ++2 90 82

100 98 92 +++4 +1 100 94

95 +++3 ++2

«102 +++4 ++1

100 +++4, ++ )

100 +++4, ++1

1,0

Таблица 2

Остаточная активность по некротическому фактору опухоли,X, при концентрации USA мг/мл

Концентрация некротического фактора опухоли, ед/мл

0 (контрольный) 1,0

Таблица 3

Концентрация

Б$Л, мкг/мл

Остаточная активность некротического фактора опухоли, хранение при о

4 С в течение 7 дней

Контроль (без стабилиаации)

Концентрации USA мг/ил:

0,1

1«10

1 к10

1 «10

1 «10

1 «1О

1 «10

1 «10

1

5

50000

5

48 б5

79

92

98

97

98

101

99

98

110