Способ хранения незрелых эмбрионов пшеницы

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционно-генетическим исследованиям, и может быть использовано в сельском хозяйстве при создании новых сортов. Целью изобретения является повышение жизнеспособности эмбрионов пшеницы. Эмбрионы, взятые на 16-20-е сутки после самоопыления, помещают на 20-24 ч в 0,30-0,75%-ный раствор диметилсульфоксида, после чего проводят дегидратацию при 2-4°С, затем осуществляют двухэтапную криоконсервацию сначала в парах, а затем непосредственно в жидком азоте. 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК щ) А 01 Н 4/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К Д ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4616542/31-13 (22) 05.12.88 (46) 15.11.90. Бюл . Р 42 (71) Институт физиологии растений и генетики АН УССР (72) В.Л.Мануильский, А.М.Бондаренко и А.Н.Зубарь (53) 578 .085.23(088 .8) (56) Pritcard Н.W. et а1; Effect of

desiccation and cryopreservation on

the in vitro viability of embryos of

the recalcitrant веем species Araucaria hunsteini К. Schum. — J. Exp Bot

1986, V. 37, Ф 182, р ° 1388-1397.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, в частности для быстрого получения селекционного материала, а также для создания новых высокопродуктивных сортов растений.

Необходимост использования в работах по клеточной селекции культуры незрелых эмбрионов вызвана тем, что геном зрелых зародыш ей более стабилен и слабо подвержен изменениям при действии различного рода мутогенных факторов. Это затрудняет проведение работ в области генной инженерии по .получению новых сортов растений. Ос— новной сложностью при работе с эм- брионами, не завершившими свое развитие, является то, - то они в искусственных условиях быстро теряют жиз„„SU„„1606045 А1

2 (54) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ НЕЗРЕЛЫХ ЭИБРИОНОВ ПШЕНИЦЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционногенетическим исследованиям, и может быть использовано в сельском хозяйстве при создании новых сортов. Целью изобретения является повышение жизнеспособности эмбрионов пшеницы.

Эмбрионы, взятые на 16-20-е сутки после самоопыления, помещают на 20-24 ч в 0,30-0,75%-ный раствор диметилсульфоксида, после чего проводят дегидратацию при температуре 2 — 4. С, затем осуществляют двухэтапную криоконсер- . вацию сначала в парах, а затем непосредственно в жидком азоте. 4 табл. неспособность и не могут храниться длительное время. Исходя из того, что для получения новых сортов растений необходимы десятки тысяч эмбрионов, вопрос об их хранении стоит остро и требует скорейшего решения. Получение незрелых эмбрионов в полевых условиях в больших количествах ограни- чено вегетационным периодом, а в искусственных условиях требуются большие площади закрытого грунта для выращивания растений. Кроме того, при хранении эмбрионы теряют необходимые для клеточной селекции свойства.

Цель изобретения — повышение жизнеспособности эмбрионов пшеницы.

Способ хранении незрелых эмбрионов пшеницы состоит B .их предварительной подготовке, дегидратации и заморажи1606045 вании, при этом семена пшеницы через

16-20 сутки после самоопыления помещают в 0,3-0,75 .-ный раствор диметилсуль4оксида (ДМСО) на 20-24 ч, после чего осуществляют дегидратацию в вакуумном эксикаторе с СаС1 при температуре (+2)-(+4) С. При уменьшении влажности незрелых семян до 20-25 их криоконсервируют путем помещения в па-10 ры жидкого азота, после чего погружают в жидкий азот. Отогрев проводят на водяной бане при +40 С. Жизнеспособность эмбрионов определяют после отделения незрелых эмбрионов от семян 15 и их культивирования на среде Гамборга. В .

Выбор температурных параметров для дегидратации в интервале (+2) (+4) С обусловлен тем, что именно в этих пределах температур происходит предотвращение функциональных повреждений тканей незрелых эмбрионов при дегидратации.

Дегидратация незрелых эмбрионов 25 о при +105 С резко снижает жизнеспособ— ность незрелых эмбрионов пшеницы вследствие повреждений, возникающих в результате нарушения ростовых процессов, обусловленных патологически- 30 ми изменениями межклеточных взаимодействий и нарушением механизмов про ницаемости мембранных структур клетки.

Снижение жизнеспособности незрелых семян при дегидратации при температу-, о 35 рах ниже 0 С свидетельствует о том, что часть слабосвязанной с макромолекулами воды, находящейся в эмбрионе, замерзает и образует кристаллы льда, которые повреждают клеточные мембраны.40

При размораживании этот лед может ре— кристаллизоваться и вызвать еще большие поврехщения клеток. Обезвоживание незрелых семян пшеницы до 20-25 .-ной влажности обусловлено тем, что при более низких или более высоких уровнях содержания воды происходит повреждение жизненно важных процессов, определяющих жизнеспособность эмбрионов после криоконсервации в условиях жидкого азота.

Проведение двухэтапной криоконсервации обеспечивает полную сохранность жизнеспособности эмбрионов . В случае проведения прямого погружения незре55 лых семян в жицкий азот происходит повреждение эмбрионов. Это связано с тем, что часть воды, составляющая подвижный компартмент слабосвязанной воды, может локально кристаллизоваться и повреждать внутреннюю ор-. ганизацию клетки.

В результате проведенных исследований установлено, что для сохранения жизнеспособности эмбрионов пшеницы важными являются следующие условия подготовки незрелых эмбрионов пшеницы к хранению . осуществление обработки на 16-. 20 сутки после самоопыления; оптимальной является концентрация криопротектора в пределах от

0,3 до 0,75 ; время инкубации незрелых зародышей в растворе криопротектора составляет 20 — 24 ч.

Пример 1. Проводят исследование опытных образцов семян пшеницы

Харьковская 11. Растения выращивают в полевых условиях. Через 14, 16,18, 20,22 суток после самоопыления незрелые семена. помещают в 0,1; 0,3;

0,5; 0,75; 1,0 -ный раствор ДМСО на

22 ч. После этого семена дегидратируют при температуре +4 С в вакуумном эксикаторе íà CaClz. При достижении влажности 20 семена замораживают путем помещения в пары жидкого азота, а затем непосредственно помещают в жидкий азот. Отогрев проводят при температуре +40 С на водяной ба-. не. Жизнеспособность отделенных от незрелых семян эмбрионов определяют путем подсчета количества каллусов на среде Гамборга В через 7 дней рекультивирования.

Результаты исследований жизнеспособности незрелых эмбрионов пшеницы сорта Харьковская 11 при инкубации в растворах ДМСО,, представлены в табл. 1.

Пример 2. Растения пшеницы сорта Харьковская 11 через 18 суток после самоопыления исследуют в эксперименте. Отделенные от растений незрелые семена погружают в 0,5 -ный раствор ДМСО на. 18,2 ),22,24,28 ч, а затем в вакуумном эксикаторе дегидратируют над СаС1 при +3 С. Далее эксперимент проводят аналогично указанному впримере 1. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.

Пример 3. Растения пшеницы сорта Харьковская 11 через 18 суток после самоопыления исследуют в эксперименте. Отделенные от растений незрелые семена погружают в 0,5 .-ный раствор ДМСО, а затем в вакуумный эксикатор и дегидратируют над СаС1

Таблица 1

Количество суток после самоопыпения

Варианты эксперимента

14 16 18 20 22

82,6 86,4 88, 1 85,9 84,3

Контроль (без обработки)

Обработка ДМСО в концентраЖ

0,1

0,3

0,5

0,75 .

1,0

НСРо 9 =О, 95

48,8 59, 1 52,1

55,5 56,9 52,2

62» 0 67 ° 4 56,7

61,7 62,9 53,4

47,2 49, 1 40,0

44,5

48,7

54,7

52,3

44,6

53 0

53,1

60,2

57,1

41,2

P 0,01

Таблнца2

Жизнеспособность незрелых эмбрионов пшеницы сорта Харьковская 11 через 18 суток после самоопыпения, инкубация в 0 5X-ном растворе ДМСО, Ж по отношению к контролю

Продолжительность инкубацин в ДИСО, ч

18 "20 22 24 28

Варианты эксперимента

Контроль (без обработки) 100 100 ° 100 100 100

Обработка в 0,5Х-ном растворе ДМСО 80,6 82,0 86,4 83, 1 70, 2

НСР„, =1,1 Рс0,01

5 160604 в холодильнике при температуре -2,0, +2, +3, +4, +8 С. Далее эксперимент

b проводят аналогично примеру 1. Ре1 зультаты эксперимента представлены в табл. 3.

Как свидетельствуют данные, приведенные в табл. 1 — 3; наилучшие результаты получены при работе с незрелыми эмбрионами через 18 суток после самоопыления, которые инкубируют в

0,5Х-ном растворе ДАССО в течение 22 ч при дегидратации в температурном интервале от +2 до +4 C.

Для подтверждения эффективности 15 способа определяют жизнеспособность незрелых эмбрионов пшеницы согласно способу-прототипу и предлагаемому способу после криоконсервации.

Сравнительные данные жизнеспособности незрелых эмбрионов после криоконсервации согласно способу-прототипу и предлагаемому способу представ-. лены в табл. 4.

Как свидетельствуют данные табл.4, предлагаемый способ более эффективен.

Выход жизнеспособных незрелых эмбрионов, обрабатываемых по предлагаемому способу, превышает выход по способупрототипу на 56Х. 30

Таким образом, преут„пагаемый способ позволяет увеличивать выход пол5 б ноценных незрелых эмбрионов, необходимых для клеточной селекции, что способствует ускорению работ по селекции новых сортов растений. Кроме того, способ позволяет осуществлять криоконсервацию незрелых эмбрионов и их хранение на протяжении длительного периода времени с высоким уровнем жив неспос об ности, что имеет важное значение для сохранения наследственных. признаков растений. формула изобретения

Способ хранения незрелых эмбрионов пшеницы, включающий их предварительную подготовку, дегидратацию и замораживание, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения жизнеспособности эмбрионов, предварительную подготовку осуществляют путем помещения эмбрионов, взятых на

16 — 20 сут после самоопыления, в

0,30-0,757-ный раствор диметилсульфоксида на 20 — 24 ч, дегидратацию проводят при температуре +2 — 4 C, и замораживание осуществляют путем двух- . этапной криоконсервации сначала в парах, а затем непосредственно в жид-, ком азоте.

1606045

Таблица3

Жизнеспособность незрелых. эмбрионов пшеницы сорта Харьковская 11 через

18 суток после самоопыления, инкубация в 0,5Х-ном растворе ДИСО, 7.

Варианты эксперимента о

Температура дегипратации, С

-2 ) +2 +3 +4 +8

63,9 84,1 88,0 88,2 88,1 74,3

44,1 61,4 67,4 67,6 67,5 51,3

Р О, 01

Способпрототип

Предлагаемый способ

Варианты экспериментаа

Жизнеспособность незрелых эмбрионов пшеницы, 43,4 (100K) НСР о,зв

Составитель В.Демкин

Редактор С.Лисина Техред M.Äèäûê Корректор Н. Король

Заказ 3504

Тираж 416

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

Контроль (беэ обработки)

Обработка в 0,5Х-ном растворе ДИСО

НСРо,дв

-1 5."

Таблица4

67,8 (156,2Х)

P(0,01