Штамм бактерий bacillus cereus-продуцент протеолитических ферментов с тромболитическим действием

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству ферментов и касается нового штамма бактерий, продуцирующего внеклеточную протеинаду с тромболитическим действием. Цель изобретения - получение штамма скорообразующих бактерий, обладающего более высокой протеолитической и тромболитической активностью. Штамм BACILLUS CEREUS ВКПМВ-4215 выделен из почв Нечерноземья и продуцирует в течение 24-42 ч ферменты с высокой протеолитической и тромболитической активностью. Протеолитическая активность культуральной жидкости достигает 50 - 110 ПЕ/мл, а время разрушения экспериментально полученных тромбов крови в опытах IN VITRO составляет 0,5 - 1 ч. Штамм не патогонен и не обладает гемолитической и коллагеназной активностью. Выделенный штамм может быть использовано для получения препаратов, используемых в лечении тромбоэмболических заболеваний.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕ(ПУ БЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ЛВтО1 СКОМУ СВИДКТКЛЬСтаМ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР.

1 (21) 4463716/31-!3 (22) 20.07.88 (46) 23.12,90. Бюл. Р 47 (71) Институт микробиологии AH СССР (72) С.Н.Паршина, A.À.Имшенецкий, Н.Г.Нестерова, В.M Терешина и С.В.Лысенко (53) 577. 15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 1531481, кл. С .12 N 1/20, 1987, Имшенецкий А,А., Черкасова Г.В. и др. О фибринолитической активностй естественных вариантов Bacillus meseutericus. Микробиология, 1987, т. 56, вып. 6. (54) ii!TAMM БАКТЕРИЙ ВАСИ.1.08 СЕКЕ08

ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

С ТРОМБОЛИТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, к про-. изводству ферментов и касается новоИзобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству ферментов, и касается нового штамма бактерий, продуцирующего внеклеточную протеиназу с тромболитическнм действием.

Цель изобретения — получение штамма спорообразующих бактерий, обладающего более высокой протеолитической

H тромболитической активностью.

Штамм бактерий Bacillus cereus

ВКПМВ-4215 (ИНМИ ПИ-59) вьщелен из почв Нечерноземья.

„,SU,, 1615177 А 1 ($i)5 С 12 И 1/20 9/54 9/68

2 го штамма бактерий, продуцирующего внеклеточную протеинаду с тромболитическим действием. Цель изобретения получение штамма скорообразующих бактерий, обладающего более высокои протеолитической и тромболитической активностью. Штамм Bacillus cereus

ВКПМВ-4215 выделен из почв Нечерноземья и продуцирует в течение .2442 ч ферменты с высокой протеолитической и тромболитической активностью. Протеолитическая активность культуральной жидкости достигает

50-110 ПЕ/мп, а время разрушения экспериментально полученных тромбов крови в опытах in vitro составляет

0 5 — 1 ч. Штамм не патогонен и не обладает гемолитической и коллагенаэной активностью. Выделенный штамм может быть использован для получения препаратов, используемых в лечении тромбоэмболических заболеваний.

Морфологические признаки. ГрампоJIoxHTeJIbHaH палочка размером 1,2—

1,5 3-6 мкм, образует овальные споры с центральным и эксцентральным и эксцентральным расположением в клетке.

Культуральные признаки. Мясопептонный агар (МПА) — колонии круглой формы, диаметром 10 мм, непрозрачные, матовые, светло-кремовые, профиль плоский, край местами лопастной.

1615177

МПА сусло-агар (1: 1) — колонии светло-кремовые, матовые „гладкие, край более зернистый.

Биохимические признаки. Каталазу

5 образует. Клетки содержат внутриклеточиые глобулы, не бкрашиваемые фук сином. Рост при 7% NaC1 +, Крахмал ,, гидролиэует. Каэеин гидролизует.

Подвижность. Клетки молодой куль туры подвижны.

Отношение к углеводам и спиртам, з глюкозы, сахарозы, мальтозы кис лоту образует,.газ не образует, из арабинозы, ксилозы, галактозы, лак тоэы, маннита кислоту не образует °

Нитраты восстанавливает в нитриты, 1 !

Желатину активно разжижает. Лецитиназная реакция положительная. Анаэробный рост отсутствует. 20

Отношение к лизоциму. Растет на (0,001Х лизоцима.

Тирозин разрушает °

Температура роста: минимальная ,10 С, максимальная 35-40 С. . 25

При культивировании штамма Bacil— lus cereus ВКПМ В-4215 засев произво,дят вегетативными клетками, выращен,ными в течение 18 ч íà МПА. Культуру выращивают в жидкой питательной среде при 28-30 С в течение. 24-28 ч, культуральная жидкость (после цент рифугирования). разрушает эксперимен тально полученные тромбы крови человека в опытах in vitro за 30-90 мин. 35

Протеолитическая активность, определенная по методу Кунитца, достигает

50"110 ПЕ/мл, а при определении по модифицированному методу Ансона с казеинатом натрия протеолитическая 40 активность достигает 12,9 ед/мл. Среда для культивирования штамма имеет следующий состав Х:;мальтоэа или картофельный крахмал 2-4; (NH4) HP0g

1-1,4, кукурузный экстракт 0,5-1,0; 45

СаС1 0,01-0,1, MgS0g 0,05-0,1, КС1

О, 1-3,2, ZnSOg 5-10 мг/л, вода водопроводная остальное.

Штамм хранят В Виде лиофильно высушенной культуры, а также на агариэо» .ванном МПА или картофельном агаре с

2Х глюкозы, под вазелиновым маслом или глицерином.

Штамм не обладает гемолитической и коллагеназной активностью, ц1тамм не патогенен. .Пример 1. Штамм В,cereus

ИНМИ ПИ-59 выращивают 18 ч на МПА, Засев проводят вегетативными клет ками.

В качестве ферментационной используют среду следующего состава, Х: мальтоза 2 (NH4) НРО 1 1,2; кукурузный экстракт 1 СаС12 О 01 Мазов

0,05; КС1 0,015; вода остальное. Через 4 1 ч культивирования на качалке с 25 мл среды в колбах Эрленмейера на 250 мл при 30 С протеолитическая активность достигает 58 ПЕ/мп, а время разрушения тромбов в опытах

in vitro 90 мин.

Пример . 2. Состав среды и условия культивирования согласно примеру 1, но дополнительно вносят

ЕпБО 0,01Х. Через 1 час культивирования протеолитическая активность

92 ПЕ/мл, а время разрушения тромбов крови 40 мин.

Пример 3. Состав среды согласно примеру 2, но культуру выращивают в 10-литровом ферментере

Биотек с. рабочим объемом 6 л при перемешивании 1000 об/мин, аэрации воздухом 1,5: 1 и температуре 28 С. о

Через 30 ч протеолитическая активность достигает 100 ПЕ/мл, а тромбы растворяются эа 59 мин.

Пример 4, Состав среды согласно примеру 2, но в качестве источника углерода вместо мальтозы используют 2% картофельного крахмала, Через 40 ч культивирования в .колбах на качалке активность протеиназы достигает 110 ПЕ/мл, а при определении по модифицированному методу Ансона с казеинатом натрия

12,9 ед/мл тромбы крови растворяются через 30 мин, П р .и м е р 5 ° Состав среды согласно примеру 3, но в питательную среду вместо мальтозы вносят 4% крахмала. Через 24 ч культивирования в ферментере АК-210 с рабочим объемом 6 л, перемешивании 600 об/мин, и аэрации 2:1 протеолитическая активность 86 ПЕ/мл, а время растворения тромбов 60 мин, Пример 6. Состав среды со„гласно примеру 4, но культуру выращивают в 10-литровом ферментере

АК-210 при аэрации 2:1, перемешивании 600 об/мин, с подтитровкой 10Х

Na0H до рН 7,0. Через 24 ч протеолитическая активность 59 ПЕ/мл, а тромбы растворяются за 40 мин. Че16151

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus cereus

ВКПИ В-4215 — продуцент протеолитических ферментов с тромболитическим действием.

Корректор А.Обручар

Заказ 3961 Тираж 498 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óàãîðîä, ул. Гагарина,101 рез 30 ч культивирования протеолитическая активность 90 ПЕ/мл, а время растворения. тромбов 30 мин.

П р и и е р 7. Состав среды согласно примеру 4, но культивирова-, ние проводят в ферментере АК-210 беэ подтитровки щелочью, аэрация 1:1, скорость перемешивания 600 об/мин, Через 48 ч протеолитическая активность 76 ПЕ/мп, время растворения. тромбов крови 60 мин.

Осажденный сульфатом аммония и очищенный методом гель-фильтрации, а 15 затем лиофильно высушенный препарат имеет активность 16 ПЕ/мг препарата.

Раствор фермента с содержанием препарата 5 мг/мл растворяет эксперимен- . тально полученные тромбы крови за

60 мин.

Составитель В.Соина

Редактор Н.Гунько Техред Л.Сердюкова

77 6 .

Предлагаемый штамм В. ceresç

ВКПМ В-4215 позволяет получать в течение 24-42 ч протеазы с высокой активностью в культуральной жидкости

50-110 ПЕ/мл, разрушающих экспериментально полученные тромбы крови в опытах in vitro за 0,5-1 ч.

Протеиназа, выделяемая штаммом

В, cereus ВКПМ В-4215, может быть использована в медицинской промышленности для получения препаратов, необходимых в лечении тромбоэмболических заболеваний.