Вектор рва 48, предназначенный для клонирования фрагментов днк в бациллах

 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для создания промышленных продуцентов. Цель изобретения состоит в повышении стабильности наследования фрагментов ДНК в условиях отсутствия селективного давления. Получен вектор, способный реплицироваться в бациллах, в частности в B. SUBTILIS и в промышленных штаммах B. AMULOLIGUEFACIENS. Вектор сконструирован на основе криптической плазмиды B. AMYLOLIGUEFACIENS. Вектор стабильно наследуется без селективного давления, сохраняется у 100% клеток в течение 40 генераций, при включении в вектор фрагмента ДНК размером 5,8 т.п.н. сохраняется у 100% клеток в течение 20 генераций.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (Д1)5 С 12 N 15/75

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4453532/30-13 (22) 04,07.88 (46) 23,12,90. Бюл. N9 47 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) IO.И.Козлов, 1О.B.éîìàíòàñ, Т.И.Уланова, Н ° В.Стойнова и В.А.Народицкая (53) 575.224,2.57.7 .2/048 (088,8) (56) PEMS Microbiol. Lett. 1988, V. 99, р. 101. (54) ВЕКТОР рВА48, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ

ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ФРАГМЕНТОВ ДНК В

БАЦИЛЛАХ (57) Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышИзобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано. для. создания промышленных продуцентов ферментов, аминокислот, витаминов, .применяемых в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и легкой промышленности.

Целью изобретения является повышение стабильности наследования: фрагментов ДНК в условиях отсутствия селективного давления.

Сконструированы на основе криптической плазмиды В. amyloliquif рВА910 векторные плазмиды, содержащие следующие области: Pst 1 — Cla I . фрагмент размером 2,0 т,п,н., где

„.,SU 161518Î А1 ленности и может быть использовано для создания промышленных продуцентов. Цель изобретения состоит в повышении стабильности наследования фрагментов ДНК в условиях отсутствия селективного давления. Получен вектор, способный реплицироваться в бациллах, в частности в В. subtilis и в промышленных штаммах В.amyloliquefaciens Вектор сконструирован на основе криптической плаэмиды

В. anyloliquefaciens. Вектор стаГ бильно наследуется без селективного давления, сохраняется у 100Х клеток в течение 40 генераций, при включении в вектор фрагмента ДНК размером

5,8 т.п.н. сохраняется у 100Х клеток в течение 20 генераций.

М® расположена детерминанта устойчивости к эритромицину и область par, которая отвечает на стабильное наследование плазмиды РВА910, Cla I

Cla I — фрагмент размером 1, 15 т. и. н. и Cla I — Pst 1 — фрагмент размером

1,25 т,п. н,, отвечающие за реплика ; цию, Пример 1. Плаэмидную ДНК рВА910 обрабатывают рестриктазой

Taq I в условиях, обеспечивающих неполный гидролиз ДНК, для чего к 4 мкг

ДНК в 50 мкл буфера, содержащего

10 мМ трис-НС1, рН 7,9, 10 мМ МдС1, 10 мМ 2-P меркаптозтанола 150 мМ

NaC1, добавляют 1 ед. активности фермента Taq I, инкубируют в тече! 615180 ние 20 мин при 65ОС, реакцию останавл ивают добавлением 125 мкл 96Х-ного этанола. После растворения осадка в бидистиллированной воде получают набор Taq I ôðàãìåíòoâ ДНК рВА9 10 с

5 различной степенью гидролиза, 5 мкг плазмиды рЕ194 сорб обрабатывают р стриктазой Taq I qo полного гидролиза, Реакцию проводят, как описа- !О но выше, но к 5 мкг ДНК добавляют ед. активности Taq I и инкубируют с есь 60 мин при 65 С. Реакцию ост навливают добавлением 125 мкл 96Хн го этанола. После растворения ДНК

T)q Т-фрагменты ДНК рВА910 и рЕ194 с )рб смешивают в соотношении 1:1 ($ мкг рВА910 и 3 мкг рЕ194 сорб) и легируют в течение ночи в 50 мкл б рферар содержащего 6 мИ трис-НС1, р1 7,6, 6 мМ MgC1, б мМ 2-P-меркапт< этанола, 50 MM NaC1. 0.5 мМ АТФ, . 20 ед, активности ДНК-лигазы фага Т4.

Полученной смесью трансформируют .клетк В. subtilis SB 112, высевают их н L-агар с эритромицином (10 мнг/мн) .

Из выросших клонов выделяют плазмиднь1е ДНК и анализируют их с помощью рестрикционного картирования. Кроме того, определяют стабильность насле, дОвания полученных плазмидр выявляют стабильно наследуемую плазмиду рР!А6013, состоящую из нескольких

Тйц I-фрагментов, обладающую устойч востью к эритромицину плазмиды рЕ;194 сорб и имеющую область репли35 кации плазмиды рЕ194. С помощью ресч1рикционного анализа выявляют Msp I—

EctoR 1 — фрагмент плазмиды рВА6013, где расположены детерминанта устойчивости к эритромицину и область рагр отвечающая за стабильное наследованне плазмиды рВА6013, Для удобства манипулирования этим фрагментом и для дальнейшего использования его в качестве метчика криптических плазмид проводят ряд генноииженерных манипуляций, 4 мкг ДНК рВА6013 в 50 мкл буфера, содержащего

10 мИ трис-НС1, рН 7,4, 6 мМ ИяС1рр

6 мИ 2- -меркаптоэтанола, 6 мМ KCl и 8 ед, активности фермента Msp I, иикубируют 60 мин при 37 С в 50 мкл. о

Реакцию останавливают добавлением

125 мкл 96Х.-ного этанола, После расч ворения плазмидную ДНК обрабатывают55 рестриктазой EcoR 1 в 50 мкл буфера, содержащего 100 мИ трис-НС1, рН 7, 10 мИ MgC1, 6 мИ 2-Р-меркаптоэтаиола, 50 мМ NaC1, 10 ед. активности

EcoR 1. Реакцию останавливают, как описано выше.

Аналогично рестриктазами EcoR 1 и Асс 1 гидролизуют 5 мкг ДНК pUC19.

Затем гидролизованные плазмидные ДНК смешивают в соотношении 1:1 и ферментативно сшивают ДНК-лигазой фага

Т4, Полученной смесью трансформируют клетки Е.coli TG-I высевают их на L-агар с ампициллином (100 мкг/мп) о

1 выращивают при 3? С 16 ч и среди ампициллин-устойчивых клонов выявляют такие, которые содержит плазмиду с искомым Msp I-Есор 1-фрагментом. Такую плазмиду называют рУС19-11.

Затем проводят рестрикцию pUC 19-11 и pBR322 рестриктазами Hind III u

Pst 1, смешивают в соотношении 1:1, сшивают ДНК-лигазой r фага Т4, легированной смесью трансформируют клетки Е.coli TG-I, отбирают клоны, содержащие плазмиду с участком Pst 1

Hind III из pBR322, Такую плазмиду называют pUC19-10. 5 мкг ДНК рВА910 и 5 мкг pUC 19-10 обрабатывают рестриктазой.ЕсoR 1, сшивают с ДНКлигазой фага Т4, полученной смесью трансформируют клетки В.subtilis

SB112 и отбирают клоны, вырастающие на L-arap e с эритр омицином (10 мкг/мп) .

Та кие клоны содержат пла змиду р ВА14, которая стабильно наследуется без селективного давления и придает клеткам устойчивость к эритромицину.

1 мкг ДНК pUC19 и 2 мкг ДНК рВА14 инкубируют с рестриктазой Pst 1 в условиях, описанных выше, проводят ферментативное легирование полученных после рестрикции фрагментов, Рестрикцированную плазмидную ДНК смешивают в соотношении 1:10 (pUC 19 рВА14) и сшивают в стандартных условиях. Полученной смесью транс» формируют клетки E.coli, отбирают на L-arape с ампициллином (.100 MKr/ìë) клоны, содержащие бирепликонную плазмиду рВА14-9. Расщепление рВА14-9 рестриктазой Е.coR 1, последующее легирование и трансформация В. subtilis SB112 позволяют выявить плазмиду рВА4, 5 мкг ДНК рВА4 обрабатывают рестриктазой EcoR в следующих условиях: 100 мМ тряс-HCl рН 7,5, 10 мМ МяС1, 6 мМ 2-P-меркаптаэтанола, 50 мМ NaC1 0,5 ед. активности EcoR 1. Объем инкубационной

5 16 смеси 40 мкл. Инкубацию проводят при

37 С в течение 20 мин. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 96 ного этанола. Затем ДНК перерастворяют в 20 мкл буфера ТЕ (10 мИ трис-НС1, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА), вносят смесь дезокситрифосфатов до конечной концентрации 0,25 мМ каждого.

Объем доводят до 30 мкл буфером ТЕ и вносят 2 ед, активности кленовского фрагмента ДНК-полимеразы Е.coli, Реакцию достройки липких концов проводят при комнатной температуре

30 мин и останавливают добавлением

75 мкл 967-ного этанола. Осадок ДНК растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 7,5, !О мИ

И@С1, 50 мМ NaCl, 0,5 MM АТФ, и цобавляют 20 ед. активности ДНК-лигазы фага Т4. Легирование проводят при

15ОС в течение 4 ч. Полученную смесь путем трансформации вводят в В,subt i1is SB112 и отбирают трансформированные бактерии после высева на агаризованную L-срецу, содержащую

10 мкг/мл эритромицина. Анализ ппазмид, выделенных из эритромицин-устойчивых клонов, позволяет выявить плазмиды с одним участком узнавания рестриктазы EcoR 1.

Пример 2, Клонирование в плазмиде рВА48 фрагмента хромосомы с геном Phe А В amyloliquifaciens.

5 мкг ДНК рВА48 инкубируют при

37 С в течение 60 мин в буфере следующего состава: 10 мИ трис-НС1, рН 7,6, 10 MM MgCl<, 2 †-меркаптоэтанол (6 MM), 150 мМ NaC1, 10 ед. активности Pst 1. Реакцию останавли- . о вают нагреванием при 65 С в течение

25 мин. 5 мкг ДНК плазмиды рРНЕА32 инкубируют при 37 С в течение 20 мин в смеси, содержащей 10 мМ трис-НС1, рН 7,6, 10 мМ MgCl., 6 мМ 2-$-меркаптоэтанола, 150 мМ ХаС1 и 1 ед, активности Pst 1. Объем реакционнои смеси 50 мкл. Реакцию останавливают прогреванием, как описано выше, Получают частично гидролизованную ДНК рРНЕА32. Гидролизованные ДНК рВА48 и рРНЕА32 смешивают в соотношении

3:1 (30 мкл рВА48 и 10 мкл рРНЕА32), добавляют АТФ цо конечной концентрации 0,5 мМ и 25 ед, активности ДНКлигазы фага Т4. Легирование проводят при комнатной температуре в течение

2 ч, Полученной смесью трансформируют В. subtilis В 112, после чего

П р и и е р 3, Проверка стабильности плазмиды рВА48.

Проверку стабильности наследования плазмид проводят следующим образом. Штаммы В.subtilis SB112, содержащие проверяемую плазмиду, рассевают на агаризованной I, — ñðåäå с эритромицином до отдельных колоний и выращивают отдельную колонию в жид55

15180 6 высевают трансформированные клетки на агаризованную срецу Спицайзена, содержащую 0,4Х. глюкозы, 50 мкг/мл триптофана, 10 мкг/мл эритромицина ° Фе5 нилаланина селективная среда не содержит. После инкубации в течение

24-36 ч вырастают колонии, При анализе плазмидной ДНК, выделенной из обра= зова вшихся колоний, выявлена пла змида рВА48-9, которая несет ген pheA В.amyloliquefaciens и обеспечивает рост

B. subt il is SB112 на минимальной среде без фенилаланина, рВА48-9 стабильно наследуется в клетках В. subtilis SB 112. 5 мкг

ДНК рВА48 инкубируют при 37 С в течение 60 мин в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-НС1, рН 7,9, 10 мМ

20 MgG1, 6 мМ 2-P-меркаптоэтанола, 150 мМ ИаС1 и 10 ед. активности

Bam H1. Реакцию останавливают добавлением 125 мкл 96Х-ного этанала. ДНК перерастворяют в буфере, содержащей

25 100 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ МяС1, 6 мМ 2-(-меркаптоэтанола, 50 мМ НаС1, добавляют 10 ед . активности EcoR 1 и инкубируют в течение 60 мин при

37ОС. Реакцию останавливают как опи30 санс выше, Аналогичным образом рестриктазами

Bam Н1 и EcoR 1 обрабатывают ДНК

pBR322. Гидролизованные, как описано выше, ДНК рВА48 и pBR322 смешивают в соотношении 1:2 и легируют в стандартных условиях ДНК-лигазой фага Т4 в течение 2 ч. Полученной смесью трансформируют Б, subtilis

SB112i клетки после трансформации высевают на агаризованную L-среду с эритромицином (10 мкг/мл). Из вы.— росших клонов выделяют плазмиды и с помощью рестрикционного анализа выявляют плазмиду рВА91, где единичные

45 участки рестриктаз расположены в следующем порядке: EcoR 1, Hind III, EcvR V, BamH1, ХЬа 1, Sac 1, Pst 1.

ДНК рВА91 вводят в протопласты В.amyloliquefaciens.

50! 615180

Составитель Т.Забойкина

Редактор Ы,Гунько Техред Л.Сердюкова

Корректор А.Обручар

Заказ 3961 Тираж 494 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 кой L-среде без эритромицина в тече.— ние 24 ч с интенсивной аэрацией. Затем в бактериальной культуре опреде— ляют титр бактерий на среде с эритро:мицином и без него, Титры сравнивают и делают вывод о стабильности той, или иной плазмиды, Пример 4. Стабильное поддержание плазмиды рВА48 при клонировании в В.amyloliquefaciens.

Плазмиду рВА48 вводят в протопласты промышленного штамма В, amyloliquefасiens А-50 известными методами, После регенерации протопласты высе,вают на агаризованную среду, содер жащую 10 мкг/мл эритромицина, Ста бильность плазмиды оценивают как описано выше. Плазмида стабильно на— следуется без селективного давления ,и сохраняется у 1007 клеток на протяжении 40 генераций, Плазмиду рВА48-9 (пример 3) содержащую ген фенилаланина, вводят в промышленный штамм и анализируют стабильность наслецования без селективного давления. На протяжении 20 генераций плазмида стабильно насле— дуется без селективного давления и сохраняется у 100Х клеток.

Таким образом, плазмида рВА48 стабильно наследуется без селективного давления в клетках бацилл у 1007 кле- ток на протяжении 40 генераций, при встраивании в эту плазмиду фрагмента

ДНК размером в 5 8 т, п ° н. стабиль5 ность наследования сохраняется в отсутствии селективного давления у

100 клеток на протяжении 20 генераций.!

О

Формула изобретения

Вектор рВА48, предназначенный для клонирования фрагментов ДНК в бациллах размером 4,4 т,п.н., содержащий — Pst 1 — С1а I — фрагмент

ДНК размером 2,0 т,п.н. с геном устойчивости к эритромицину из рС194 и областью par, отвечающий за стабильное наследование из криптической плазмиды рВА 910, С1а I — Cia I фрагмент ДНК плазмиды рВА 910 размером 1,15 т.п.н., С1а I — EcoR 1 фрагмент ДНК плазмиды рВА 910 разме" .

25 ром 1,2 т.п,н,, EcoR 1 — Pst 1 фрагмент ДНК плазмиды pUC19 размером 0.05 т.п.н., генетические маркеры: Em " — ген устойчивости к эритромицину; уникальные сайты рестрикции: EcoR 1, $ас 1, Крп 1, Sma 1,.

Bam Н1, ХЬа 1, Pst 1, емкость — не менее 5,8 т.п,н.