Штамм бактерий rнizовiuм lеguмinоsаruм вiоvаr viceae для получения бактериального удобрения под вику

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур, и представляет собой штамм клубеньковых бактерий, используемых для предпосевной обработки семян вики. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий вики с более высокой эффективностью симбиотической азотфиксации для производства бактериального удобрения под вику. 1Чтамм бактерий Rhizobium leguminosarum biovar biceae № 0622 выделен из клубеньков вики посевной, экотипа из Марокко, произраставшей на дерново-подзолистой , хорошо окультуренной почве. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером ВНИИСХМ № 0622. Штамм 0622 позволяет увеличить в среднем урожай зернавики на 6 ц/гк (25,6%), влажной зеленой массы - на 27 ц/га (8,8%) и сухой зеленой массы - на 12,0 ц/га (16,2%) по сравнению с известным штаммом. 5 табл. I (П

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)5 С 05 F ii/08, С 12 N I/20 //

//(С 12 N 1/20, С 12 R 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

КГ60 1/3-,„

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ производства бактериального удобрения под вику.

Бактерии штамма ЕМzobium leguminosarum biovar biceae У 0622 выделены из клубеньков вики посевной, экотипа из Марокко, произраставшей на дерново-подзолистой, хорошо окультуренной.почвз.

Штамм R.leguminosarum bv. viceae депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

l1O ИЗО6Р1=ТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ AEHT СССР (21) 4660289/13 (22) 09.03.89 (46) 23.02.91. Бюл. 9 7 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии (72) А.Т.Новикова, В.Л.Князева, А.П.Кожемяхов и Н.Г.Орищенко (53) 631.847.211(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 629733, кл. С 05 Е 1!/08, 1977. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВНТКOHIUM LFGUMIN0SARUM BI0VAR 7?СЕАЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД ВИКУ (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур, и представляет собой штамм клубеньковых бактерий, используемых для предИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур, и представляет собой штамм клубеньковых бактерий, используемых для предпосевной обработки семян вики.

Целью изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий вики с более высокой эффективно- стью симбиотической азотфиксации для

„„SU„„1629295 А 1

2 посевной обработки семян вики. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий вики с более высокой эффективностью симбиотической азотфиксации для производства бактериального удобрения под вику. Штамм бактерий Rhizobium leguminosarum biovar

biceae У .0622 выделен иэ клубеньков вики посевной, экотипа иэ Марокко, произраставшей на дерново-подзолистой, хорошо окультуренной почве. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером ВНИИСХМ Р 0622. Штамм 0622 позволяет увеличить в среднем урожай зерна вики на 6 ц/гк (25,67), влажной зеленой массы — на 27 ц/га (8,87) и сухой зеленой массы — на 12,0 ц/га (16,2X) по сравнению с известным штаммом.

5 табл.

1629295

45 во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под ¹ 0622.

Культурально-морфологические признаки штамма. Штамм 0622 растет на питательных средах. Гороховый агар, г/л: горох 100,0; сахароза .20,0; агар 20,0; рН среды 6,8-7,0. Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит

10,0; К НРО 0,5; NgSOyх 7Н О 0,2;

НаС1 0,1 дрожжевой экстракт 0,4; агар.15,0; рН среды 6,8-7,0.

Маннитно-дрожжевой агар с бромтимол синим, г/л: маннит 10,0;

К НРО4 0,5; MgSOyx7H

0,1; дрожжевой экстракт 0,4: агар

15,0; бромтимол синий 5 мл; 0,5% спиртового раствора, рН среды 6,87,0.

Бактерии штамма №- 0622 имеют фор- 20 му палочек: до 36 ч подвижные, через

48 ч утрачивают подвижность, перитрихи, грамотрицательные. Величина клеток 2-суточной культуры на гороховом агаре 1,2-1,8х0,7-0,8 мкм. Бактери- 25 циды имеют ветвистую форму. Быстрорастущая культура. Штрих на гороховом

arape умеренный, бесцветный, алабовыпуклый, слизистый, стекающий. Колонии появляются на 3-и сутки, однотипные, круглые, выпуклые, слизистые, беловатые до 2 мм.

На маннитно-дрожжевом arape штрих обильный, бесцветный, плоский, слизистый, стекающий. Колонии появляются на 3-и сутки, однотипные, круглые, 35 слабо-растекающиеся, выпуклые, слизистые, беловатые до 3 мм. На маннитно-дрожжевом агаре с бромтимол синим признаки штамма 0622 аналогичны росту на маннитно-дрожжевом агаре, но культура и среда окрашиваются в желтоватый цвет, Физиолого-.биохимические признаки штамма ¹ 0622.

Молоко с лакмусом не пептонизирует, подщелачивает с образованием слизистой прозрачной зоны на поверхности, Подщелачивание молока с лакмусом происходит на 2-е сутки, максимальное изменение окраски отмечается на

3-5-е сутки. Образование слизистой зоны происходит на 3-и сутки, максимальных размером (до 3 мм) она достигает через 15 сут. Маннитно-дрожжевбй агар с бромтимол синим подкис55

i ляет.

Желатину не разжижает. Аэроб, о оптимум температуры 26"28 С при оп" тимуме рН 6,8-7,0. Предельные значения рН для роста 5,8-7,5.

Отношение к углеродам, Растет на средах с углеводами, подкисляя среду.

Активно усваивает глюкозу, галактозу, рамнозу, ксилоэу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маннит, сорбит, клетчатку и крахмал не используют.

Отношение к источникам азота. Хорошо растет на средах с азотнокислым натрием, аммонийными солями, тирозином. На МПА не растет, Признаки штамма устойчивы. Штамм не патогенен.

Штамм № 0622 хранится на гороховом агаре при 4-5 С и пересевается один раз в 6 мес.

Технология приготовления препарата на основе штамма № 0622.

Посевную культуру выращивают на качалке в колбах и пятилитровых бутылях в течение 2 сут на среде следую— щего состава, мас. : гороховый агар

10,0; сахар,(пищевой) 1,0; (NH )zSÎ

0,05; КНдРОс, 0,05 . К НРО,,ЗН О 0,05 Mg$0 i 7Н О О,02. СаСО О 1 водопроводная вода до 100,0; рН после стерилизации (1,0 атм, 30 мин) 6,8-7,0. Титр клеток 3-4 млрд/мл.

Посевную культуру используют для приготовления жидкой рабочей культуры. Ее готовят в пятилитровых бутылях или фермантаторах на среде следующего состава, мас.%: кукурузный экстракт

1,0; меласса 2,0; (ЕН ) 80,1 О,1;

КН Р01. 0,025; К НРО4iЗН О 0,025;

MgSOp 7Н О 0,02; CaCOg 0,1; водопроводная вода до 100,0; рН после стерилизации 6,8-7,0.

Бутыли и ферментаторы засевают посевной культурой клубеньковых бактерий в количестве 5%, Бутыли встряхивают на качалке в течение 40-48 ч.

В ферментаторах бактерии выращивают

18-36 ч при аэрации 0,7-1,5 об/мин под избыточным давлением 0,3-0,5 атм, при 28 30 С Титр 4 5уО млрд/мл.

После микробиологического контроля культуральную жидкость из бутылей или ферментаторов — инокулюм используют для смешивания с торфом, Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный меломдо рН

6,8-7,0,влажностью 30-40 в полиэтиле,новых пакетах по 200-400 r стерилизуют гамма-облучением при дозе 2 5 Мрад.

Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией смеси: культуральная жидкость + меласса (б ) из расчета исход162929

Спосо6 внесения препарата с ер щий: 200 г ризоторфина разводят н

1,5 л водопроводной воды и, не давая суспензии -отстаиваться, наносят ее на гектарную норму семян. Затем сеного титра бактерий н торфе 0,30,5 млрд/г торфа и влажности 45"60Х.

Затем пакеты загружают в специальные смесители, при вращении которых перемешивается их содержимое. Культуру в торфе подращинают, выдерживая пакеты

3-5 сут при )5-20оС Ризоторфин хранят при 3-8 С в темном сухом помещео нии отдельно от ядохимикатов. 10

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин для вики на предлагаемом штамме представляет по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, нерастворимую в воде. Влажность готового препарата

50-55%. Ризоторфин содержит 4-6 млрд клубеньковых бактерий на 1 г торфа.

Срок годности препарата 6 мес со дня изготовления, Расход препарата 200 г 20 на гектарную норму семян.

Условия проведения вегетационных и полевых опытов. Вегетационные опыты проводят в сосудах с 6 кг дерновоподзолйстой -почвы с внесением солей 25 по прописи Прянишникова, r/êã почвы;

КС1 0,15; MgS04 0,06; СаНР04 0,172;

МпБО4 0,003; борная кислота 0,003; (%14) Мо04 0,001; но без азота. Повторность опыта четырехкратная. 30

Используются районированный сорт вики Немчиновская 72. Для инокуляции семян ники чистую культуру бактерий выращивают на скошенном гороховом агаре. .Культуру в пробирках с титром 4-6 млрд омывают водопроводной водой, затем суспензию наносят на семена вики, разложенные в лунки, сделанные н почве каждого сосуда.

В сосуд вносят 10 клеток.

Полевые опыты проводят в районах, рекомендованных для возделывания ни ки, на почвах, типичных для этих регионов. Используется агротехника выращивания вики, принятая в каждом 45 конкретном районе. Доза препарата

200 r на гектарную норму семян. В опытах используются районированные сорта вики: Немчиновская 72, Белорозовая 109, Камалинская 611. Повторность опытов четырехкратная. В полевых опытах семена вики обрабатывают торфяным препаратом-ризоторфином, изготовленным, на опытах штаммах.

5 6 мена тщательно перемешивают для равномерного распределения преп. рата.

Обработанные ризоторфином семена высеивают в тот же день но влажную почву. Площадь опытных делянок 10-20 .м

Пример 1. Эффективность симбиотической аэотфиксации у штамма

У 0622 в сравнении с известным штаммом У 145 определяют в вегетационных опытах, поставленных по описанной методике, по величине урожая зеленой массы вики.

Полученные данные приведены в табл.1.

Kaid показывают данные табл.1, клубеньконые бактерии вики штамма У 0622 обеспечивают более высокую эффективность азотфиксации, в результате чего урожай зеленой массы растений, инокулированных этим штаммом, на 20,7Х выше, чем у растений, бактеризованных штаммом У 145. Содержание общего азота у растений, инокулированных штаммами, было одинаковым, но за счет более высокого уровня зеленой массы при бактеризации штаммом Р 0622 накопление азота н этом варианте на 21,6 выше, чем от штамма Р 145.

Пример 2 ° Эффективность штаммов R leguminosarum Ьч. viceae У-0622 и Р 145 определяют в полевых опытах по конкурсному испытанию штаммов клубеньковых бактерий вики в научных учреждениях Географической сети опытов с азотфиксирующими микроорганизмами (табл.2) по величине урожая зерна и зеленой массы (влажной и сухой).

Данные табл.2 показывают, что штамм Р 0622 отличается от известного штамма Р 145 более высокой и стабильной эффективностью. Средняя грибавка урожая зерна, зеленой массы (влажной и сухой) вики составляет 9,4, 76,5 и 21,0 ц/га соответственно,.что на

6,0 (25,6 ), 27 (8,8 ) и 12,0 ц/ra (16,2 ) превышает урожай, полученный при использовании штамма Р 145, кото-. рый в ряде опытов не обеспечивает достоверного повышения урожая (опыты

1 и 4) ° Содержание белка в урожае вики, инокулированной штаммами Р 0622 и У 145, было одинаковым.

Влияние штаммов Р 145 и Р 0622 клубеньковых бактерий вики на содержание белка в урожае (полевые опыты) показано в табл.3.

Условия проведения полевых опытов и эффективность штаммов Р 145 иР 0622

1629295

Таблица 1

Варианты инокуляции

Прибавка урожая к штамму N- 145

Накопление азота

Урожай надземной масСодержание общего азота на сосуд, мг г/состав

% сы, г/состав в растениях, %

«1

21,6

30,5

37,1

0,94

1,05

1,06

20,7

0,6

Таблица 2

Прибавка ур ная ot нтан ма Р 0622 п сравнению с нтамном е 14

Бид .продукта

Урокаи в конт ропе, ц/га

Прибавка урокая при испольео888ББнтвнмов татнсти

eckIA обаботка ц/га р 145 р 0622 р 145 р 0622 ц/га Й

l5 0

25,5

Z0,3

199

Зерно о

Немчиновская 72

Бело-розовая 109

Среднее

Вело-роэовая.109

6,0 3,$

3,6 3,7

4,2

7,9

6,0

25,5

25,7

25 6

10,0

5,7 10 38,0 !

3,1 20,4 51,4

9>4 15 ° 2 44 ° 7

)l9 45,2 . 59,8

I 5

5,2

3,4

Зеленая масса

S2 4S8

9 ЭЯ

49>5 76 ° 5

10,9 15,6

7>1 26>4. 4 Немчиновская 12

Среднее

5 Немчиновская 72

6 Баналинская 611

2,3 25,3

7,6

8,8

7, l

25,2

27

4 7

19 3

2,1 10,3

24,0 35>1

l9>9 28,4

l0 2 Э7,9

329

264

54>9

69>6

2,0 3 9

4,4 3,9

Сукая зеленая масса

62>3 9>0 21>0 15>l 33>Z 12>0 16>2

Среднее клубеньковых бактерий вики даны в табл.4.:

Как показывают данные табл.4, штамм

18 0622 дает значительную большую при5 бавку урожая зеленой массы вики, чем штамм У 145.

Пример 3. Дополнительным преимуществом штамма У 0622 являются его. высокие технологические свойства, при-10 веденные в табл.5.

Данные табл.5 показывают, что по основным технологическим показателям бактерии штамма 1г 0622 превосходят штамм 11 145, т.е. более интенсивно размножаются на жидких регламентных средах, дают более высокие титры в торфяном препарате. Особо следует отметить стабильность показателя высокой

Без инокуляции. 2,3

Штамм 11>145 2,9

Штамм 11>0622 . 3,5

P 3,2%;

НСР— 0,3 г/состав выживаемости бактерир1,, в препарате при хранении.

В изученных регионах возделывания вики при бактеризации ее семян ризоторфином на основе штамма 11> 0622 получают более высокую урожайность зерна и зеленой массы, чем при использовании штамма 11> 145. Кроме того, предлагаемый штамм клубеньковых бактерий вики превосходит штамм Р 145 по технологическим свойствам.

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhizobium leguminosarum biovar viceae BHHHCXM

Р 0622 для получения бактериального удобрения под вику.

1629295

Содержание белка в урожае,7 при использовании штаммов

Сорт вики

h"- 145 . N - 0622!

5,8

18,8 !

8,4

Показ.атели

Вариант

2 млрд/г

Чернозем южный карбонатный. 200 с титром 3-5

Дерново-подзолистая, хорошо окультурен-,. ная

Немчиновская 72

12

Камалинская 611

20

Не вносят

329

69,6

7,1

26,4

34

2,3

25 3

4,5

3,9

15,6

15,8

Штамм Титр бактерий, млрд/мл

145 2,2

0622 2,9

4,3

5,5

Немчиновская 72 15,6

Бело-розовая 109 18,7

Немчиновская 72 18,5

Доза препарата на 1 га,г

Почва Сорт вики

Повторность и

Площадь делянки, м

Количество минерального удобрения — нитроаммофоса, ц/га

Урожай зеленой массы в контроле, ц/га

Прибавка урожая зеленой массы, ц/га, от штаммов:

1!2 145, !!2 0622

Статистическая обработка

Р, 7

НСРО 5, Содержание белка, 7:

У 0622

Ф в посевной в рабочей культуре культуре

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Титр бактерий в торфяном препарате, млрд/г, при сроке хранения

10 дн. 1 мес. 3 мес. 6мес.

0,7 4,4 2,9 0,9 .

l,6 5,5 8,2, 5,5