Способ получения фруктозилдисахаридов

 

Изобретение относится к микробиологическому синтезу веществ, касается способа получения фруктозилдисахаридов, пригодных в качестве сахаристых веществ в пищевой промышленности , специфически известных как TGF. Получаемые фруктозилдисахариды представляют собой промежуточный продукт для использования при получении сукралозы (ранее известной как TGS). Цель изобретения - повышение качества целевого продукта. Способ предусматривает проведение реакции альдозы с сахарозой или рафинозой в присутствии фруктозилтрансферазы, продуцируемой Bacillus subtilis NCIB № 11871, 11872 или 11873, имеющей Km для дахарозы по меньшей мере 0,1 М в отсутствие акцептора альдозы, которая не образует значительных количеств левана, осаждаемого спиртом из донора фруктозы в отсутствие акцептора альдозы, стабильной к действию поверхностно-активных веществ, которая обладает оптимальной активностью при 30°С, к активной в течение по меньшей мере 20 мин при температуре до 45°С. Предлагаемый фермент не проявляет инвертазной активности что благоприятно влияет на качественныехарактеристики целевого продукта , а также не ускоряет реакцию диспропорционирования, т.е0 не превращает олигосахариды с малой молекулярной массой в леван с высокой молекулярной массой, 1 з.п. ф-лы, -1 табл. из OS со о С5

1630617 А3

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9) {И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 37 57 905/1 3 (22) 20,06,84 (31) 8316790 (32) 21,06.83 (33) GB (46) 23.02.91. Бюл, ¹ 7 (71) Тейт энд Лайл Паблик Лимитед

Компани (GB) (72) Эльнер Брин Ратбоун, Эндрю

Джон Хакинг, Петер Самуэль и Джеймс

Читэм (GB) (53) 577.11(088.8) (56) Hestrin and Avigad. J. Biochem, 1958, 69, р. 388-398.

Патент Великобритании ¹- 2046757, кл. С 08 В 37/00, опублик. 1980 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРУКТОЗИЛДИСА- ХАРИДОВ (57) Изобретение относится к микробиологическому синтезу веществ, касается способа получения фруктозилдиса харидов, пригодных в качестве сахаристых веществ в пищевой промьппленности, специфически известных как

TGF. Получаемые фруктозилдисахариды представляют собой промежуточный продукт для использования при получе"

Изобретение относится к микробиологическому синтезу веществ, каса,ется способа получения фруктозилдисахаридов, пригодных в качестве сахаристых веществ в пищевой промьппленности, специфически известных как

TGP (получаемые. фруктозилдисахариды представляют собой промеж)/точнйй про(Я)5 С 12 Р 19/12, ) 9/18 (С 12 P 19/18, С 12 R ):125) 2 нии сукралозы (ранее известной как

7GS). Цель изобретения — повьппение качества целевого продукта, Способ ,предусматривает проведение реакции альдозы с сахарозой или рафинозой в присутствии фруктозилтрансфераэы, продуцируемой Bacillus suhtilis NCIB

¹ 11871, 11872 или 11873, имеющей Km для сахарозы по меньшей мере 0,1 М в отсутствие акцептора альдозы, которая не образует значительных количеств левана, осаждаемого спиртом из донора фруктозы в отсутствие акцептора альдозы„ стабильной к действию поверхностно-активных веществ, которая обладает оптимальной активностью при 30 С, и активной в течение по меньшей мере 20 мин при температуре до 45оС, Предлагаемый фермент не проявляет инвертазной активности что благоприятно влияет на качественные характеристики целевого продукта, а также не ускоряет реакцию диспропорционирования, т.е, не превращает олигосахариды с малой молекулярной массой в леван с высокой молекулярной массой, 1 з,п ° ф-лы, -1 табл.

1 дукт для использования при получении сукралозы, ранее известной как TGS),, Цель изобретения — повышение качества целевого продукта.

Изобретение предусматривает полу" чение фруктозилдисахаридов общей формулы проведением реакции альдозы общей формулы,1630617

ОН пп ОН Zj

НО 0Н

I ,. где А — водород или группа СНдХ;

Х вЂ ;,.;,водород, алифатическая или 1О ароматическая карбоксигруппа

;ь или алкоксигруппа или арилалкоксигруппа, с сахарозой или рафинозой в присутствии фруктозилтрансферазы, продуцируе- 15 мой Bacillus suhtilis NCIB P- 11871, 11872 или 11873, характеризующейся

Km для сахарозы по крайней мере 0,1 М в отсутствие акцептора альдозы, не образующей значительных количеств осаждаемого спиртом полисахарида-. левана из донора фруктозы в отсутствие акцептора альдозы, и стабильной к действию поверхностно-активных веществ, имеющей оптимальную активность при 30 С, активной не менее

20 мин при 45ОС, Используемый фермент не проявляет инвертазной активности, что благоприятно влияет на качественные характеристики целевого 30 продукта. Km для фруктозилтрансфера! зы, полученной из В.suhtilis NCIB

)1871, составляет 0,2 M для сахарозы в отсутствие акцептора, в отличие от известного, Km которого равна

0,02 M.

Используемая фруктозилтрансфера.за не ускоряет реакцию диспропорционирования, т,е. не превращает олигосахаридьг с малой молекулярной мас- 40 сой в леван с высокой молекулярной массой.

Источником фруктозы для реакции может быть любой олиго- или дисахарид, содержащий, предпочтительно, 45 незамещенное р-фруктозильное кольцо, присоединенное к аномерному углероду альдозы связью (1 — — -;»2), как в сахарозе ((-П-фруктозил-g-D-глюкопиранозид), рафинозе (Π†-0-галактопиранозил-(1 в -.-6)-О-g(-D-глюкопиранозил-(1 в -,21-+D-фруктофуранозид) или стахиозе °, .Реакцию между донором и акцептором фруктозы проводят при РН 5,46,0 и 30 С, оптимальных значениях для действия фермента, который, предпочтительно, используют иммобилизо- ванным На нерастворимой подложке.

Продуцируемые фруктозилтрансфераэой штаммы В.subtilis по классическим тестам отвечают требованиям идентификации видов. В.subtilis NCIB 11871 является-лактозоотрицательным, показывающим различное продуцирование кислоты и ксилозы. В.subtilis NCIB

11872 также является лактозоотрицательным и дает отрицательные Результаты с D-маннозой, мелибиозой и трегалозой в реакции СИРС. В.subtilis NCIB

11873 является лактозоположительным и дает отрицательные результаты с D-маннозой и инулиН0.

Пример 1. Получение 6-ацетата сахарозы, а) Получение фермента. Р-Фруктозилтрансферазу получают при культивировании Васiflus subtilis, штамм NCIB

11871. Фермент индуцируют сахароэой в процессе роста клеток во встряхиваемых колбах (емкость 250 мл, 4 колбы), содержащих минимальную сахароэную среду (100 мл на колбу). Культуру инкубируют до последней экспонентной фазы микроорганизмов, встряхивания при 30 С, затем содержимое четырех колб объединяют и культуральную среду отделяют от клеток путем центрифугирования (5000 g в течение 15 мин), 20-30% общего количества фермента остается в ассоциации с клетками, Полученную надосадочную жидкость доводят до 65% насыщения путем до бавления твердого сульфата аммония и оставляют стоять в течение 45 мин при 0 С, В результате этого в осаб док выпадает основное количество нежелательной инвертазы и других белковых составляющих, а большая часть фермента остается в растворе. Затем образец повторно центрифугируют (20000 g в течение 30 мин) и выгружают осадок, содержащий инвертаэу.

Добавляют. еще сульфат аммония в раствор для доведения его до 95% насыщения и оставляют стоять еще на 45 мин при О С, Образуется второй осадок, в основном фруктозилтрансфераза, которую собирают центрифугированием (40000 g в течение 45 мин) и повторно растворяют в 12 мл 50 мМ фосфатного буфера, РН 6,0. Результатом двух осаждений и растворения второго осадка является очистка и концентрация фермента, такая, что с помощью электрофореза с полиакриламидным гелем обнаружена только од1630617 на полоса белка, Оставшийся суль фат аммония удаляют из системы получения фермента путем диализа (О С в течение 4 ч) в присутствии 50 мМ фосфатного буфера.

Подвергнутый диализу фермент ис— следуют перед и после добавления п-оксиртутьбензоата, который подавляет инвертаэу, но не оказывает действия на фруктозилтрансферазу. Обычно этим способом определяют., что препараты фруктозилтрансферазы свободны от инвертазы. Содержание протеинов в препаратах оценивают примерно

0,45 мг/мл путем определения абсорб- ции белков при длине волны 280 нм.

Черный пигмент часто присутствует даже в очищенных ферментных препаратах, но он не оказывает влияния на их активность ° б) Получение 6-ацетата сахарозы, 6-Ацетат глюкозы (80 г высушивают в вакууме до постоянного веса) и гранулированную сахарозу (160 г) растворяют при .комнатной температуре в

100 мл буферного раствора Макилвайна при рН 5,4 и разводят до 600 мл (т.е.

40 мас.Х) деионизованной водой. Этот раствор затем профильтровывают и добавляют 28 мл раствора фермента. Реакционную смесь инкубируют при 30 С. отбирают через определенйые временные интервалы образцы до тех пор, пока по данным ЖХВД не устанавливают, что 6-ацетат сахарозы больше не образуется и достигнута максимальная концентрация 6-ацетата сахарозы

120 г/л. Фермент удаляют фильтрованием реакционной смеси через колонку с ДЭАЭ целлюлозой, которая адсорбирует фермент. Другим способом его можно было денатурировать путем нагревания при 65 С в течение 1 ч.

Удаление фермента важно, так как он может способствовать медленному гидролизу 6-ацетата сахарозы и высвобождать фруктоэу.

Затем продукт выделяют с помощью препаративной ЖХВД и получают 6-ацетат сахарозы по меньшей мере 65 чистоты при общем выходе 50Х. Начальная скорость реакции ферментации составляет 244,5 мг 6-ацетата сахарозы на 1 мг фермента в час. Выход на стадии ферментации составил 58Х в .расчете на.расход 6-ацетата глю. козы или 48Х в расчете на образовавшийся 6-ацетат сахарозы.

Пример 2. Получение. 6-деоксисахарозы.

Выделение, очистка и кристалли5 зация. 6-Деокси-D-глюкозу (D-хиновозу, 20 г) и сахарозу подвергают реакции, аналогичной реакции, описанной в примере 1, и получают смесь 6-деоксисахарозы, D-хиновозы, сахарозы и глюкозы, общий объем 140 мл. 6-Деоксисахарозу отделяют от смеси с помощью препаративной ЖХВД, используя колонку с обратной фазой waters

prepak 500-С1.8 и воду в .качестве

15 элюента. Наблюдается удивитель но большое различие во времени удерI жания 6-деоксисахароэы и времени (удержания других компонентов смеси.

D-хиновоза, сахароза и D-глюкоза элюированы через 4-9 мин после введения, а 6-деоксисахароза только через 29 мин (высота максимального пика)..Длительное время выделения позволяет выделить больное количество

25 вещества за инъекцию, чем было бы возможно в другом случае. Элюат, содержащий 6-деоксисахарозу, выпаривают досуха при пониженном давлении (температура бани 50 C) и получают

30 прозрачный сироп (16,7 г, 42X) который кристаллизуется при комнатной температуре..Продукт рекристаллиэуют иэ этанола и он имел т.,пл. 180! 81 С, $Q)> +57,6 (с 2,5, вода) .

Масс-спектр, m/е: 293 (И -СН -Нф) .

1 С-ЯМР-спектр (DqO раствор, относительно молекулярного ДСС при 0 м.д.:

Атом углерода Химический сдвиг м.д.

40 21 106,32

1 94, 70

5 84,01

3 79,04

5 77,74

45 4 76,73

3 74 ° 93

2 73,95

4 71,09

6 65,02

50 11 63,77

6 19,36

Пример 3. Повторяют процедуру, описанную в примере 1, но вмес" то 6-ацетата на стадии б используют

55 6-бензоат г покозы. Получают анало-! гичный результат..

Пример 4, Способ, описанный в примере 1, модифицируют, используя фермент, полученный при культиви7 1630617 . 8

Используя субстрат ксилоза-саха— роза для приготовления ксилсахарозы, концентрацию и активность истощен1 ного раствора, оставшегося после завершения процедуры иммобилизации, сравнивают с концентрацией и активностью первоначального ферментного препарата. Обнаружено, что 68,5Х первоначально присутствовавшего фермента в клеточном экстракте было иммобилизовано вместе с 83Х первоначапьно при1 сутствовавшего белка. Иммобилизо-ванный фермент имеет первоначальную активность 80,2Х от активности эквивалентного количества свободного фер1 мента; активность обоих препаратов соответственно равна 0,38 г ксилсахарозы / r иммобилизованного ферменровании штамма Марбург 168, штамм

NCIH 11872 или 11873 на стадии б. Реакция проходит таким же образом, но с меньшей скоростью.

П р и м е-р 5. Иммобилизация и

5 очистка фруктозилтрансфераэы штамма

NCIR 11871 с использованием ионообменной ДЭАЭ целлюлозы и получение ксилсахарозы.

Ионообменную ДЭДЭ целлюлозу (DE 52) интенсивно промывают 50 мМ буфером

Макилвайна рН 5,4 и затем забуференным субстратом (сахароза-ксилоза 2:1, 40 мас.Х, общие сахара). После фильт- 15 рования почти досуха через воронку

Бюхнера ДЭАЭ целлюлозу (10 r) смешивают с 8 мл препарата фруктозилтрансферазы, полученной при культивировании В.subtilis, как в примере 1, в течение 15 мин при 30 С при

1перемешивании, Полученную смесь ДЭАЭ

1 целлюлозы и фермента загружают в

l10-миллилитровую колонку с водяной рубашкой (19xl см) и поддерживают при,25

30 С с помощью термоциркулятора Черчилла. ДЭАЭ целлюлозе дают стечь под действием собственной тяжести и эти стоки собирают. Субстрат закачивают вверх по колонке со скоростью

1,0 мл/ч, используя насос Ватсона-.

Марлоу, элюат.собирают через определенные промежутки времени и исследуют на активность фруктозилтрансферазы, Также определяют поглощение на длине волны 280 нм (DQSo). Для исследования О,1 мл жидкого образца или 0,1 г иммобилизованного фермента (на DE 52) инкубируют с 2 мл субсто рата при 30 С в течение 4 ч., 40 та в час и 0,865 г ксилсахарозы/ мл экстракта фермента B час.

Иммобилизованный фермент (10 r) непрерывно подают в колонку при 30 С в течение 2 нед при постоянном рН элюата, микробиологическое заражение исключено. В течение первых трех дней небольшие количества белка и фермента. десорбировались (примерно

24 первоначально адсорбированного белка и 2,3Х первоначально адсорбированного фермента). Активность иммобилизованного фермента падает с временем полураспада 95 ч, и имеется обратная зависимость между степенью конверсии субстратов в продукты и скоростью течения по колонке.

При самой малой скорости потока, 0,086 объемах колонки без насадки (экв./ч ) и 80Х конверсии в ксилсахарозу получают элюат, содержащий

21 г/л ксилсахарозы. Этот выход выше, чем выходы, полученные в периодических реакциях, вероятно потому, что кинетика течения со структурным ядром колонки способствует образованию ксилсахарозы, так как про-. дукты непрерывно выгружают из колонки и, таким образом, они не аккумулируются и не вызывают замедление реакции, В целом в процессе этих операций 20"25 r ксилсахарозы образуются в состоянии, из которого легко получить чистую ксилсахарозу.

В противоположность первоначально использованному растворимому ферменту иммобилизованный фермент вызвал образование в процессе реакции побочных продуктов. Образовалось незначительное количество фруктозы — меньше, чем образуется с помощью первоначального экстракта фермента, использованного для иммобилизации, вероятно потому, что инвертаза, которая загрязняет экстракт, только частично адсорбирована DE 52. В элюате после иммобилизованного фермента были обнаружены некоторые второстепенные соединения, которые были элюирова; . ны на последней стадии И(ВДсо временем удерживания 13 и 20 мин, хотя их не обнаруживали при анализе продуктов реакций с растворимыми ферментами. Вероятно это огтигосахариды, об- разовавшиеся иэ обычных реагентов с помощью фермента. Предположительно, что удерживание молекул реагента иммобилизованным ферментом увеличивает

)6306)7

: время их контакта с ферментом таким образом, что существует воэможность полимеризации.

Так как содержание ксилозы в субст-5 рате составляет 133 г/л, то максимально возможная концентрация ксилсахарозы составляет 266 г/л. Максимальная концентрация при 0,086 экв./ч. сбставляет 801 от этой величины, т.е. )p

210 г/л, а расчетные данные на осно. вании расхода ксилазы во время реак1 ции составляют 69, 57. Выход .выше, чем в периодических реакциях, так как природа процесса "течение со структурным ядром" такова, что она обусловливает постоянный отток продукта, и так как продукт относительно неполярный по сравнению с субстратом и поэтому избирательно отводится от поло- 20 жительно заряженной иммобилизирующей подложки, то оба эти эффекта способствуют образованию ксилсахарозы.

Этот же способ используют для получения 6-ацетата сахарозы иэ 6-аце- 25 тата глюкозы, 6-0-метилсахароэы из

6-О-метилглюкозы и 6-0-бензилсахарозы из 6-0-бензилглюкозы.

Фермент, полученный по способу, описанному в примере 1, (0,1 мл) сме- 30 шивают с 2 мл 40_#_.-ного (мас,/об,) раствора сахарозы и ксилозы (1:1), забуференного при рН 5,5 при 30 С.

Наличие ксилсахарозы определяют с по.мощью ЖХВД. Образование левана опре- .-3 деляют визуально. Ниже приведены результаты сравнения действия различных ферментов.

Эти ферменты по изобретению преобразуют по меньшей мере в 10 раз 40 больше ксилсахарозы чем фермент, полученный с помощью штамма Марбурга, и по меньшей мере в 100 раз больше в случае использования фермента, полученного с помощью штамма

NCIB 11871. Причем значительно. меньше идет конкурирующее образование левана.

Использование рафинозы в качестве донора.

Пример 6. Образование ксилсахарозы, Рафинозу и сахарозу растворяют в буфере Макилвайна (рН 5,4) и инкубируют с фруктозилтрансферазой из примера 1 при 30 С до момента, когда анализ ph/с показал, что больше не образуются ксилсахароза и мелибиоза (примерно 100 ч . Затем фермент денатурируют путем нагревания (или в альтернативе его можно удалять путем адсорбции в ДЭАЭ целлюлозу). Измеряют как количества ксилозы и рафинозы при общей концентрации сахара

30 мас.Е, так и абсолютную концентрацию сахаров, при отношении рафино,sa: ксилоэа 2:1 (мас./мас.). Наибольшие концентрации ксилсахарозы, полученные в ходе этих экспериментов, cciставляют 9,5 г/100 мл при концентрации субстрата 65 г/100 мл. Затем ксилсахароэу изолируют посредством преиаратного lip/с, представляющего собой последний пик, подлежащий элюированию, с временем вьщерживания

15,5 мин (ксилоэа около 3 мин, рафиноза и мелибиоза примерно по 7 минут каждая).

Пример 7. Образование 6-деоксисукрозы, Осуществляют реакцию рафинозы и б-деоксиглюкозы, как было описано, используя отношение рафиноза: 6-деоксиглюкоза 2:1 и общую концентра- цию сахара 307.. По истечении времени инкубации примерно 40 ч получают

4 г 6-деоксисахарозы на 100 мл субстрата.

Результаты исследований по примерам 1-7 приведены в таблице, Формул а и з о б р е т е н и я

1. Способ получения фруктозилдисахаридов общей формулы

А сн он

НО " 0 ) г г г

--СН20Н

НО Он Ho OH

- (i) где А — водород или группа СНОХ, Х вЂ” водород, алифатическая или ароматическая карбоксигруппа, ипи алкоксигруппа, или арилалкоксигруппа путем проведения реакции альдозы общей формулы

«"ОН

ОН

НО ОН

1630617

Ксилсахароза, г/мл фермента в час

Образование

Источник фермента левана

8,6

2,9

1,4

Заметно

0,08

0,19

0,87

Составитель И.Привалов

Техред N.Дидык Корректор Ì.Пожо

Редактор В, Данко

Заказ 445 Тираж 351 Подписное

ВНИИПО Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101 где А имеет указанное значение, определенное для формулы (II), с сахарозой или рафинозой в присутствии фермента гликозилтрансферирующего действия, продуцируемого Васillus subti5

1is при оптимальных условиях действия фермента, отличающийся тем, что, с целью повьпления качества целевого продукта, в качестве фермента гликозилтрансферирующего действия используют фруктозилтрансферазу, продуцируемую Bacillus subtilis NCIB

11871, 11872 или 11873, имеющую Km для сахарозы по меньшей мере 0,1 N в отсутствие акцептора альдоэы, не образующей значительных количеств осаждаемого спиртом левана из донора фруктозы в отсутствие акцептора альдозы, и стабильную к действию по- 20 верхностно-активных веществ, имеющую оптимальную активность при температуре 30 С, активную не менее 20 .. о мин при температуре до 45оС

2, Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что используют иммобилиэованный фермент.

NCIB 11871

NCIB 11872

NCIB 11873

NCIB 3610 (Марбург)

®ермент

31)9/1976

В.subtili:s

var Haecharoliticus

NCIB 9966/Erwinia 6-erbicolor