Способ иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Целью изобретения является упрощение и ускорение способа иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях. Для этого используют в качестве антигена культуру клеток FLK, выращенную до образования монослоя на твердофазном носителе, после чего высушивают и пермеабилизируют глютаровым альдегидом. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4645691/13 (22) 02,02.89 (46) 28.02.91. Бюл. N 8 (71) Институт биохимии АН ЛитССР (72) Н.П.Дикинене, Д.Ю.Адомайтене, Г.Ю. Микалаускене и А.Э. Вел ецкайте (53) 616.988(088.8) (56) Kajikawa О., Ко1ата Н., Sasaki Т., loshlkawa Т., Saito Н. Studies on enzyme

linked immunosorbent assay (EZISA) for

detektion of antibodyes in cattle infected with

bovine leukemic virus. Ipn. Vet. Sci., 1983, ч.45(3), рр.347 — 353, Ложа В.П. и др, Выделение бычьего вируса лейкоза из продуцирующих культур клеток и изучение стабильности вибрионов.

В кн.: Репродукция и биологические свойства онкорно-вирусов. Рига, 1979, с.60-72, Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях.

Пример 1. Для иммобилизации антигена клетки перевиваемой культуры FLK, продуцирующие вирус лейкоза КРС, высеивают в стерильные 96-луночные полистироловые панели в объеме 100 мкл ростовой среды (среда Игла с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы) в концентрации 2,8

10 клеток/на лунку и выращивают до об4 разования монослоя в атмосфере с 5% СО2 и 96% влажности при 37 С в течение 48, ч.

Затем удаляют культуральную жидкость, отмывают клетки 0,01 М фосфатным буфером

БЫ, 1631434 А1

fsi)s G 01 N 33/53, А 61 К 39/395, С 12 Q 1/70 (54) СПОСОБ И М М У Н О Ф Е Р М Е Н Т Н О ГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, Целью изобретения является упрощение и ускорение способа иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в биологических жидкостях. Для этого используют в качестве антигена культуру клеток FLK, выращенную до образования монослоя на твердофазном носителе, после чего высушивают и пермеабилизируют глютаровым альдегидом. 1 табл. рН 7,2 (ФБ) и высушивают панели в течение

18 ч при 37 С. Подготовленные таким образом панели используют непосредственно или хранят при комнатной температуре в течение нескольких месяцев, Для пермеабилизации клеток в лунки вносят по 100 мкл 0,25%-ного глутаральдегида, выдерживают 10 мин при комнатной температуре и 3 раза отмывают ФБ, Для блокирования неспецифических мест связывания в луйки вносят по 100 мкл Ьлокирующего раствора, состоящего из 3%-ного раствора человеческого сывороточного альбумина, приготовленного на ФБ, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, после чего раствор удаляют встряхиванием, С целью проведения реакции антигена с антителом в лунки вносят по 100 мкл исследуемых сывороток, содержащих антитела

1631434

55 к вирусу лейкоза КРС . исследуемую сыворотку мышей (ИСМ), иммунизированных вирусом лейкоза КРС, а разведении от 1:500 до 1:2000; положительную коммерческую сыворотку крови-коров (ПКС) в рабочем разведении, содержащую антитела к вирусу лейкоза КРС; исследуемую. сыворотку коров (ИСК) в разведении от 1:10 до 1:640 и культуральную жидкость гибридов (КЖГ), продуцирующих антитела к вирусу лейкоза

КРС, в разведений от 1:2 до 1:256. Сыворотки разводят в блокирующем растворе.

ИСМ получают при использовании следующей схемы иммунизации; 80 мкг лизированного вируса с полным адъювантом

Фрейнда вводят внутрибрюшинно. Через месяц вводят антиген трехкратно с интервалом одной недели, Бустерное введение — в хвостовую вену, 50 мкг белка.

В качестве отрицательного контроля используют сыворотку крови здоровых мышей (0MC) в разведении 1:100; коммерческую отрицательную сыворотку KPC (ОСК), несодержащую антител к вирусу лейкоза КРС, в разведении 1:64.

Панель с исследуемыми биологическими жидкостями иНкубируют 2 ч при 37 С.

Несвяэавшиеся антитела удаляют и панель промывают 4 раза, как описано.

Для инкубации с мечеными антителами в лунки вносят по 10 мкл конъюгата кроличьих антител к иммуйоглобулинам мыши или к иммуноглобулинам быка с пероксидазой хрена в разведений 1:1000 в блокирующем буфере и инкубируют при 370С 1 ч, после чего 4 раза промыйают ФБ.

Для выделения пероксидазной реакции в лунки вноясят по 100 мкл субстрата =

2,2 -азино-ди(1-атил-бензотиазолин сульфоI нат) (ABTS), инкубируют 45 мин при комнатной температуре в темноте. Ферментативную реакцию останавливают добавлением по 100 мкл 2 -ной лимонной кислоты.

Для установления интенсивности окраски продуктов пероксидазной реакции определяют их опатическую плотность (ОП) спектрофотометрически при длине волны 416 нм с дальнейшим вычислением оптической величины (ОВ) по формуле:

ОВ ОП исслед емого образца

ОП котлрольного образца

Например, при определении антител к вирусу лейкоза KPC в сыворотке мышей, иммунизированныМ вирусом лейкоза КРС, оптическая плотнос1.ь(ОП) исследуемого образца равна 0,943, а ОП контрольного о6разца, т,е, сыворотки крови здоровых

45 мышей, равна 0,304. Делим 0.943 на 0,304 и получаем ОВ, равную 3,1.

Пример 2, Для получения антигена вирус лейкоза KPC выделяют (по прототипу) из перевиваемой культуры клеток линии

FLK, продуцирующих вирус лейкоза КРС, Проводят количественное определение вируса лейкоза КРС в культуральной жидкости по ревертазной активности. Культуральную жидкость затем осветляют при 1000 g в течение 20 мин при 4 С. Надосадочную культуральную среду центрифугируют при

5000 — 10000 g в течение 20 мин при 4 С и вирусные частицы концентрируют в изопикнической зоне путем прокачивания со скоростью 3,75 л/ч насосом "Beckmann-441" осветленной и охлажденной до 2 С культуральной жидкости через проточный ротор

СФ-32 ультрацентрифуги "Beckmann-(-575", в которой на 607;-ной подушке сахарозы создают в буфере ТН3 (0,01 M трис-HCI, рН 7,2; 0 1 М NaCI; 0 001 Ма2 ЭДТА) линейный градиент сахарозы от 20 до 50 (по массе) при 30000 или 32000 об/мин. После центрифугирования содержимое ротора при 3000 об/мин разделяют на фракции, каждая объемом 20 мл. Количество вируса лейкоза КРС в каждой фракции определяют по его ревертазной активности.

В лунки полистироловой панели вносят по 100 мкл раствора вируса с концентрацией 1 мкг/мл в 0,005 M карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5 — 9,7. Панель оставляют при 4 С на ночь.

Несорбированный вирус лейкоза KPC удаляют встряхиванием, лунки панели трижды промывают 0,05; -ным раствором твина-20, приготовленным на ФБ, после чего вносят в лунки по 100 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на ФБ (блокирующий раствор), инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Раствор удаляют и в лунки вносят по

100 мкл исследуемых; контрольных сывороток или культуральной жидкости гибридом (разведение как описано в примере 1).

Панель с исследуемыми биологическими жидкостями инкубируют 2 ч при 370С.

Несвязавшиеся антитела удаляют и панели промывают.

Ийкубацию с мечеными антителами, с субстратом и определение продуктов пероксиданой реакции спектрофотометрически проводят как описано в примере 1.

В таблице приведены сравнительные данные оптических величин по определению антител к вирусу лейкоза KPC в разных биологических жидкостях, полученные предлагаемым и известным способами.

1631434 гатого скота, включающий нанесение антигена на твердофазный носитель, инкубацию с исследуемой биологической жидкостью, последующее внесение и инкубацию с мече5 ными пероксидаэой антителами к IgG крупного рогатого скота, внесение субстрата и определение продуктов пероксидазной реакции, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и его ускорения, в каче10 стае антигена используют культуру клеток

FLK, которую предварительно выращивают на твердофазном носителе до образования монослоя, высушивают и пермеабилизируют глютаровым альдегидом.

Оптическая величина

Разведение биологической жидкости

Биологическая жидкость

Число клеток в лунке или концентрация анти гена, мкгlмл

Оптическая плотность

Антиген (ОП) (ОВ) ИСМ*

ОСМ

ПКС

ОКС

ИСК

ОСК

КЖГ

ОКЖ

ИСМ

ОСМ

ПКС

ОКС

ИСК

ОСК

КЖГ

ОКЖ

2,8 10

Пермеабилизированные клетки линии Р1 К (по предлагаемому способу) 3,16

3,04

2,55

2,86

Вирус лейкоза KPC (по известному способу) 10

3,10

2,96

2,75

3,12

* Обозначения см. премер 1.

Составитель С.Светлышев

Редактор М.Бандура Техред М.Моргентал Корректор M.Ìàêñèìèøèíåö

I 3

Заказ 541 Тираж 417 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Как видно из таблицы, сравнение оптических величин, полученных предлагаемым способом и известным, показывает, что предложенный способ позволяет выявить антитела к вирусу лейкоза KPC в исследуемых биологических растворах не в ущерб точности. При этом оптическая величина (ОВ), полученная по известному способу, находится в интервале от 2,75 до 3,12, в то время как ОВ по предлагаемому способу находится в таком же самом интервале, т.е, от 2,55 до 3,16, Формула изобретения

Способ иммуноферментного определения антител к вирусу лейкоза крупного ро1:1000

1:1000

В рабочем разведении

1:320

1:320

1:128

1:128

1;1000

1:1000

В рабочем разведении

1:320

1:320

1:128

1:128

1,161

0,367

0,992

0,326

0,897

0,352

0,990

0,345

0,943

0,304

1,100

0,371

0,890

0,323

0,970

0,310