Векторная плазмидная днк ртк 1285, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины, и способ ее конструирования

 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинатную плазмиду, обеспечивающую интеграцию чужеродного генетического материала в геном вируса осповакцины (ВОВ) штамма ЛИВП. Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического материала в составе вируса осповакцины штамма ЛИВИ. Новая плазмидная ДНК рТК 1285 состоит из фрагментов генома ВОВ штамма ЛИВП, расположенных на расстоянии 142-736 н.п. и 769-1379 н.п.от HindIII-сайта рестрикции К-фрагме нта генома ВОВ, полилинкера длиной 80 н.п.. содержащего уникальные сайты рестрикции Clal, Hindlll, Xbal, Sal GI, Вал-HI, PvuII и Eco RI, векторной части, имеющей последовательности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2068-4357 н.п., плазмиды pBR 322. Полученная генно-инженерная плазмида характеризуется способностью интегрировать в геном ВОВ чужеродный генетический материал, например ген VP1 вируса гепатита А штамма HAS 15 с поздним промотором ВОВ Р, . 2 с.п. ф-лы. § (Л

(51)5 С 12 Н 15!7.9.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и АВТОРСЙОЬМ СВИД Е ГЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЯТ

ПО ИЭОИ%ТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ.ССО (21 ) 4499300/1 3 (22) 25.10.88 (46) 07 ° 04. 91. Вюл. И 13 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) Г. Г. Приходько, И. Х.Урманов, О.И. Серпинский, Н. Н.Микрюков и В.Е. Чижиков (53) 575. 224. 2: 577. 2 (088. 8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ì 1354709, кл. С 12 И 15/00, 1985. (54) ВЕКТОРНАЯ ПЛАЗМЩДНАЯ ДНК рТК

1285, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ИНТЕГРАЦИИ .ЧУЖЕРОДНОГО ФРАГМЕНТА В ГЕНОМ ВИРУСА

ОСПОВАКЦИНЫ, И СПОСОВ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ (57) Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой рекомбинатную плазмиду, обеспечивающую интеграцию чужеродно ro генетического материала в геном вируса осповакцины (ВОВ) штамма ЛИВП.

Изобретение относится к генетиче ской инженерии и биотехнологии, а именно к получению рекомбинантов вируса осповакцины (ВОВ).

Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетического материала в составе ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП.

Сконструйрована рекомбинантйая плазмида рТК 1285, содержащая векторную часть, а также нуклеотидную последовательность. ТК-гена. ВОВ штамма ЛИВП с полилинкером внутри него...SUÄÄ 1 4 164 А1

Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чужеродного генетическо го материала в составе вируса осповакцины штамма

ЛИВП. Новая плазмидная ДНК рТК 1285 состоит из фрагментов генома ВОВ штамма ЛИВП, расположенных на расстоянии 142-736 н.п. и 769-1379 н.п.от

HindIII-сайта рестрикции К-фрагмента генома ВОВ, полилинкера длиной 80 н.п., содержащего уникальные сайты рестрикции ClaI, НхпйХ?Т, Xbal, Sal GI, Ва1П- HI PvuII и Есо RI векторной части, имеющей последовательности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2068-4357 н,п., плазмиды pBR 322.

Полученная генно-инженерная плазмида @ характеризуется способностью интегри- фф ровать в геном ВОВ чужеродньй генетический материал, например. ген VP1 С:! вируса гепатита А штамма НА$15 с поздним промотором ВОВ Р,, 2 с.н. ф лы °

Ю

Основное требование к -выбору полилинкера - наличие уникальных участ- ©, ков узнавания рестриктаз типа II.

Причем участки гидролиза рестриктаз, содержащиеся в составе полилинкерной области, удаляют из векторной .части и вирусспецифической последовательности вй

Сконструированная плазмидная ДНК рТК 1285 размером 3598 н.п. состоит из: векторной части в виде ClaI-Pvull—

Фрагмента ДНКплазмиды рВВ.322 длиной

1640164

2313 н.п., которая является производной плазмиды pBR,322 и не содержит, участка узнавания рестриктаэы Есо RI . (делеция нуклеотидной последовательности ААСААТТ, полученная в результа4358 2 те последовательной обработки ДНК

pBR 322 ферментами Есо RI и S где цифрами отмечены положения крайних нуклеотидов, а также кодируют геи устойчивости к ампициллину в качестве генетического маркера; фрагмента генома ВОЗ штамма ЛИВП, содержащего последовательность ТК-ге- 15 на от 142 до 1379 н., имеющего только два сайта рестрикции {СХаХ и

F,со RI),è отличающегося в трех положениях (328 н. G, üC, 9?О н. А- 6, 1010 í. A G) от первичной структуры

Н пйХХХ-Х вЂ” фрагмента генома ВОВ штамма MR с полилинкером лазмиды

pUR 278, содержащим участки узнавания рестриктаз ClaI, HindIII, ХЬаХ, Sal GI, Bam HI, PvuII и Есо RJ..

Способ конструирования рекомбинантной плаэмидной ДНК рТК 1285 включает в себя! гидролиэ S — нуклеазой Есо RI— ха неаризованной плазмидя pBR 322 с 3 целью удаления Есо RI-сайта рестрикции в векторной части; клонирование HindIII — К- и .

HindIII — PvuII-фрагментов ДНК ВОВ штамма ЛИВП; 35 гидролиз 8 — нуклеазой НЫйХХХХЬаХ-линеаризованной плазмиды рТК

1708, с целью удалении участков рас» щепления рестриктаз ClaI, HindIII и XbaI в векторной и вирусспецифичес-. 40 кой частях; ,лигирование Clal-RuII- u ClaIВзрХ -фрагментов ДНК плазмиды рТК

1567 с целью удаления PvuII-сайта рестрикции; клонирование СlаХ-Есо RI-полилин кера плазмиды pUR 278 в плазмиде рТК 1238.

Предлагаежй способ конструирования существенно отличается от извест- 50 ных тем, что с помощью обработки

ДНК Я -нуклеаэой удаляют природные сайты рестрикции Есо RI, МпйХХХ, 1

XbaI u PvuII и получают последова. тельность ДНК с метилированным аде- 55 нином в участке узнавания СlаХ

° + (27 н.) для штаммов Е.со1х dam -фе" нотипа, что позволяет ввести полилинкер с уникальными сайтами расщепления рестриктаз, узнающих гексануклеотидные последовательности ДНК, внутрь

ТК-гена.

Сущность изобретения заключается в том, что для интеграции чужеродного генетического материала в геном

ВОВ конструируют плаэмидный вектор, содержащий ТК-ген и прилегающие районы HindIII — К-фрагмента ДНК ВОВ штамма ЛИВП, отличающийся тремя нуклеотидами от первичной структуры

HindIII — I-фрагмента генома ВОВ штамма MR и имеющий только два сайта крупнощепящих рестриктаэ в вирусспецифической последовательности ДНК, по которым клонируют полилинкер. Искусственно введенные 7 уникальных сайтов рестрикции используют для кло-. нирования чужеродных генов, которые методом контрансфекции интегрируют в

ДНК ВОВ.

Й р и м е р 1.Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pBR 322 ц

5 мкг плазмидной ДНК pBR 322 расщепляют эндонуклеазой рестрикции

Есо RI (5e.а.) в 10 мМ трис-НСl, рН 7,5; 10 мМ 2"меркаптоэтанола, 0,1 мИ NaCl 10 мМ NgC1 при 37ОС

60 мин, как описано. Проводят осаждение ДИК этанолом и обрабатывают нуклеазой S (I e.а.) и 0,2 мМ NaC1

50 мИ ацетата Na (рН 4,5}; 1 мИ

ZnS0<; 0,5%-ного глицерина при 37 С и 30 мин. Реакцию останавливают добавлением до 50 мМ ЗДТА. После осаждения препарата ДНК спиртом проводят лигирование. Реакционная смесь содержит 5 мкг ДНК„ 30 е.а. ДНК-лигазы фага Т4; 50 мМ тряс-НС1, рН 7,5; 0,5 мИ

АТР; 10 мМ 2-меркаптоэтанола; 5 мИ

MgC1, Инкубация проходит от „1 до

18 ч при .8 C. После тепловой денатурации белков добавляют до 0,1 мМ NaCl и 5 е.а. Фермента Есо RI и выдерживают 60 мин при 37 С. ДНК осаждают спиртом. Далее проводят трансформацию компетентных клеток штамма Е.соИ

НВ101 и анализ на наличие в плазмидах .

ДНК сайта рестрикции Eco RI, Одна as колоний, содержащая устойчивую к эндонуклеазе рестрикции Есо ВХ плазмидную ДНК(рВК 322 4, наращивается в среде LB с ампициллином (100 мкг(мл) и тетрациклином (20 мкг/мл). Нлаэмид" ную ДНК выделяют щелочным методом и секвенируют методом Максама-Гилберта от ClaI-сайта рестрикции.

1 6401

Пример 2. Клонирование

HindIII — К-фрагмента генома ВОВ штамма ЛИВП.

ВОВ штамма ЛИВП растят на культуре клеток ВНК-21 и выделяют по из5 вестному методу. Полученный препарат ,. вируса разбавляют четырьмя объемами . ТЕ-буфера и осаждают вирус центрифугированием (40 000 g, 30 мнн, ООС).

Осадок ресуспендируют в ТЕ-буфере до концентрации 10 " вирусных частиц на

1 мл и проводят депротеинизацню в

0,1 мИ ЭДТА; 0,5Х-ной N-лаурилсаркозината Na» 100 мкг/мл протеиназы К при 4пС 3 ч. Затем повьппают концентрацию детергента до 4Е и инкубируют

2 ч при 50 С. Полученный лизат центрифугируют (250 000 g, 15 ч, 18ОС) в ступенчатом градиенте концентраций 20

CSC1, приготовленном из равных объемов растворов СаС1 в 1 х SSC, имеющих плотность 1 8 и 1,7 г/см . Зону

ДНК извлекают и диализуют против ТЕбуфера. 25

200 мкг вирусной ДНК расщепляют эндонуклеаэой рестрикции HindIII (5 е.а.) в 10 мИ трис-НС1, рН 7,5;

10 мИ 2-меркаптоэтанола; 50 мМ NaCj»

1О мИ И@С1 при 37 С 60 мин. Электро- 30 элюцией выделяют Hindlll — К-фрагмент

ДНК из 0,8Х-ного агарозного геля и лигируют с HindXII-линеаризованной плазмидой pBR 322 Ь. После трансформации лигазной смесью компетентных клеток штамма Е.со1х НВ 101 проводят отбор колоний фенотипа "Ар Тс и рестрикционный анализ плазмидных ДНК (pBRHK) °

Пример 3. Рекомбинантные плазмидные ДНК рТК 1708, рТК 1567, рТК 1238 и PTK 1285 °

Плазмидную ДНК pBRHK подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции

PvuIX в стандартных Условиях u cmusa- 45 ют ДНК-лигазой фага Т4 по примеру

Лигаэной смесью трансформируют компетентные клетки шта»жа Е.со11 НВ 101 и отбирают колонии, содержащие рекомбинантные плазмиды с HindIII — PvuII50 фрагментом ДНК длиной 1708 н.п. (рТК 1708).

Плазмидную ДНК рТК 1708 расщепляют последовательно рестриктазами

HindXII и ХЬаЕ, выделяют больший фрагмент ДНК, который инкубируют с - нуклеаэой S по примеру 1. Затем пре парат ДНК сшивают ДНК-лигазой фага

Т4 и проводят трансформацию компе64 6 тентных клеток штамма Е.coli HB 101.

Колонии, содержащие плазмидные ДНК, устойчивы к эндонуклеазам рестрикции

HindIII и XbaI, имеют одну точку разрыва для рестриктазы ClaI и нарабатывают в cpepe LB. Плазмидные

ДНК выделяют щелочньм методом н секвенируют район соединения векторной части и вирусспецифической последовательности ДНК. Плазмидную ДНК, которую называют .рТК 1567, нарабатывают в препаративном количестве и используют на следующем этапе.

Плазмидную ДНК рТК 156? расщепляют совместно рестриктазами ClaI u

PvuII. Выделяют больший фрагмент ДНК и сшивают с ClaI-Bspl-фрагментом ДНК длиной 634 н.п. плазмиды рТК 1567.

Лигазной смесью транспортируют компетентные клетки штамма Е.coli НВ 101 и отбирают колонии, содержащие плазмиды, устойчивые к гидролизу рестриктазы. PvuII (рТК 1238), а вирусспецифическую нуклеотидную последовательность ДНК определяют методом МаксамаГилберта и проводят сравнительный анализ с первичной структурой HindIIII-фрагмента генома ВОВ штамма WR.

Описанное последовательное кон-. струирование плазмиды ДНК позволяет получить рекомбинантную ДНК, не содержащую сайты рестрикции ферментов

HindIII, XbaI u PvuII. Наличие двух уникальных участков рестрикции в плазмидной ДНК, выделенной из штамма .

Йаш -фенотипа, эндонуклеаз ClaI u

Есо КХ позволяет ввести в ТК-ген полилинкер.

Плазмидную ДНК pUR 278 расщепляют ферментами рестрикции ClaI и Есо RI в стандартных условиях, выделяют

ClaI-Eco RI-фрагмент ДНК длиной

80 н.п. и клонируют в плазмиде рТК

1238 по С1aI и Ксо RI-сайтам. Целевую рекомбинантную плазмидную ДНК рТК

1285 отбирают методом ДНК-ДНК-гибридизации и подвергают рестрикционному анализу эндонуклеазами рестрикции, имеющими участки узнавания в полилинкере.

Пример 4. Получение рекомбинантного В0В, содержащего ген VP1 вируса гепатита А штамма HAS 15.

Плазмидную ДНК pHAV 23 расщепляют рестриктазами HindII u Bam HI в стандартных условиях и выделяют фрагмент

ДНК длиной 141 н.п., содержащий Nконцевую часть гена UP1BlA, из 4Х-но7 164016 го ПААГ после злектрофореза. НЫЙХХ3am HI-фрагмент ДНК сшивают с синте» хическими олигонуклеотидами ХХ и III

„и PstI-Bam HI-линеаризованной ппаз.. мидой pUC 1 8 с помощью ДНК-лигазы фаза Т4. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма

E.coli IM 103. Колонии фенотипа 1асЕ вырабатывают на среде ХВ. Выделяют плазмидную ДНК, чувствительную к рестриктазам Psti и Вап HI(pUC 18ИЧРХ-HAV) и секвенируют от HindIIXсайта методом Иаксама-Гилберта.

Плазмидную ДНК pUC 18-NtP i-HAV расщепляют эндонуклеазами рестрикции

PstI и Ваш-НХ и выделяют меньший фрагмент ДНК длиной 155 н.п. Парал- . лельно проводят гидролиз рестрикта-.. зами Clai и Есо RX плазмиды рИРЗ и @ выделение ClaI-Kco RI-фрагмента ДНК протяженностью 546 н.п., содержащего поздний промотор Рц В0В. Фрагменты

ДНК длиной 155 и 546 н.п. и синтети.ческий олигонуклеотид Х лигируют с 25

ClaI-Bam HI-векторной частью плазми ды рТК 1285. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма

Е.Coli НВ 101 и отбирают колонии ДНКДНК-гибридиз ацией. Рекомбинантные .мо- 30 у ДНК (pTK 1285 - Р4, -НЧР1-НАЧ) анализируют рестриктазами Clai, Есо

Ri Рзti n Bam HI.

Плазмидную ДИК рНАЧ 23 гидролизуют зндонуклеазами рестрикции Bam. HI и

РчиХХ. С-концевую часть гена VP1

-ВГА длиной 671 н.п. выделяют из 47-но..го ИААГ и сшивают с Ваш ИХ-Pvuil-ли- . неаризованной нлазмидой рТК 1285Р -NVP1-HAV. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штка

E.coli НВ 101 Отбирают колонии ДНКДНК-гибридизацией и плазмидные ДНК (рТК 1285-Р -ЧР1-НАЧ)подвергают реу анализу В сКо<сТр7 о 45 ванной нлазмидной ДНК определяют первичную структуру состыкованных участков метопрм Иаксама-Гилберта.

ДНК плазмиды рТК 1285-Р -VPt-HAV используют для трансформации клеток почки зеленой мартьппки СЧ-Х, зараженных ВОВ штамма ЛИВП. Урожай вируса

) после трансформации высевают на монослой перевиваемой линии клеток

Н143. В присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина отбирают вирусные TKклоны. Методом ДНК-ДНК-гибридизации проверяют наличие гена ЧВ1 ВГА в кло- нах. Вирусную ДНК клона 809 выделяют. по примеру 2 и подвергают анализу рестриктазой Hind III.

Таким образом, сконструирована новая рекомбинантная плазмидная ДНК рТК 1285„ имеющая расширенный состав уникальных сайтов рестрикции внутри

ТК-гена ВОВ (ClaI, HindIII, ХЬаХ, Заl СХ, Bam HI, Pvull и Есо RI), что существенно расширяет выбор стратегии клонирования чужеродных генов.

Определена нуклеотидная последовательность TK-гена и прилегающих районов генома ВОВ штамма ЛИВП, необходимая для рекомбинации с вирусной

ДНК. Показаны отличия первичной ° структуры ТК-генов между нтаммами

ЛИВП и NR. На примере гена ЧР1 вируса гепатита А продемонстрирована возможность использования плазмида рТК

1285 для получения вирусных рекомбинатов.

Формула изо бре тения

1. Векторная плазмидная ДНК рТК

1285, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины размером 3598 н.п,, соде рж вщая. фрагменты ДНК рВЕ 322, имеющие последовательности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2068-4357 н.п. с геном устойчивости к ампнцнллину; фрагменты ДНК осповакцины, расположенные на расстоянии 142-736 н.п., и 769-1379 н.п. от HindIII сайта ре-. стрикции К-фрагмента генома ВОЗ штамма JIHBII кодирующие N- и С-концевые части ТК-гена соответственно:

ClaX — Есо RI - полилинкерный фрагмент ДНК плазмиды pUR 278 длиной

80 н.п., с участками узнавания рестриктаз Clai HindIXI ХЬаХ, Яаl СХ, Bam НХ, Р". :Xl и Есо Ri; уникальные сайты рестрикции: Clai

НЫЙХХХ, ХЬаХ, Sal И, Bam HI PvuXI и Есо ЕХ; генетические маркеры, amp — устойчивость к ампициллину; емкость от 100 до 1,4 тыс. н.п.; штаюы-хозяева: штаммы Е.eoli

dam -фанотипа, 2. Способ конструирования векторной плазмидной ДНК рТК 1285 предназначенной для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины, заключающийся в том, что удалением Есо RI-сайта в плазмиде

pBR 322 с помощью нуклеазы S полу1640164

Составитель Е. Кузнецова

Редактор И.Дербак Техред Л,Олийнык Корректор М. Самборская

Заказ 997 Тираж 386 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101

4 чают Векторную плазмидную ДНК pBR

322, в которую по HindIII-сайту клонируют ТК-ген вируса осповакцины, штамма ЛИВП в составе HindIII-К-фрагмента вирусного генома, в полученной

5 плазмиде pBRHK делетируют PvuIIфрагмент, содержащий часть HindIII-Kфрагмента ДНК вируса осповакцины и часть ДНК плазмиды рВИ. 322 Ь, содержащий структурную часть гена устой.. чивости к тетрациклину, после чего из полученной плазмиды рТК 1708 с помощью.нуклеазы S удаляют.HindIII- и

ХЪаХ-сайты Рестрикции, в полученной плазмиде рТК 1567 делетируют BsplPvuII-фрагмент ДНК длиной 328 н.п., содержащий С-концевую часть вирусспецифической последовательности ДНК, с помощью лигирования линеаризованной С1аХ-PvuII-плазмидной ДНК с

ClaI-BspI-фрагментом вирусной ДНК размером 643 н.п., по Есо КХ-С1аХ сайтам полученной промежуточной плазмиды рТК 1238 встраивают Есо RI-ClaIполилинкер ДНК pUR 278, и получают ,целевую рекомбинантную плазмидную

ДНК рТК 1285.