Способ получения бактериального пирогена

 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к получению бактериальных пирогенов, используемых в лечебной практике для стимуляции естественных защитных сил. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в следующем. В качестве источников используют экспериментально полученные методом половой конъюгации с использованием высокоэффективных доноров эшерихий группы HfrH(/T) гибриды шигелл Флекснера и эшерихий. Проводят предварительное удаление клеточных липидов, лиофилизацию, суспендирование биомассы в дистиллированной Н-0, многократное воднофенольное экстрагирование (2:1) с использованием свежеперегнанного фенола, температура экстракции 65- 70°С с последующим центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин), диализом в течение 3 сут через пергаментную бумажную мембрану с размером пор 10- 20 А, удельной поверхностью пор 1000- 1200 мг/г и толщиной 0,16-0,20 мм, предварительно промытую хлороформметанольной смесью (2:1) для обезжиривания , упаривание при 30°С с использованием жидкого азота, ультрацентрифугирование в режиме: 108000 об/мин, 1 ч, три раза с последующей лиофильной сушкой полученных продуктов. 2 табл. с/ с

COI03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 15/03

j-

Ги

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A STOPCHQMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И .СЛНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

{21) 4339698/1 3 (22) 04. 11. 86 (46) 07.04.91. Бюл. В 13 (71 ) Владивостокский ro сударственный медицинский институт (72) Н.С.Мотавкина, Т.К.Каленик и И. Б. Кальнин (53) 575.224.2(088.8) (56) Westphal О. et al. Bacterial lipopolysaccharides extraction with phenol water and further applicatiosns

of the procedure. — Methods in Carbohydr. Chemistry, 1965, v.5. р.83-91. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО

ПИРОГЕНА (57) Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к получению бактериальных пирогенов, используемых в лечебной практике для стимуляции естественных защитных сил.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ . заключается в следующем. В качестве источников используют экспериментальИзобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к

-получению бактериальных пирогенов, используемых в лечебной практике для стимуляции естественных защитных сил организма.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

В качестве источников липополисахаридов (ЛПС) используют экспериментально полученные методом половой коньюгации с использованием высоко.,SU.„1640165 А 1

2 но полученные методом половой конъюгации с использованием высокоэффективных доноров эшерихий группы

НйгН(ф ) гибриды шигелл Флекснера и эшерихий .. Проводят предварительное удаление клеточных липидов, лиофилиэ ацию, суспендирование биомассы в дистиллированной Н О, многократное воднофенольное экстрагирование (2:1) с использованием свежеперегнанного фенола, температура экстракции 6570 С с последующим центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин), диализом в течение 3 сут через пергаментную бумажную мембрану с размером пор 10. 20 1, удельной поверхностью пор 10001200 м /г и толщиной 0,16-0,20 мм, предварительно промытую хлороформметанольной смесью (2:1) для обез, жиривания, упаривание при 30 С с использованием жидкого азота, ультрацентрифугирование в режиме:

108000 об/мин, 1 ч, три раза с последующей лиофильной сушкой полученных продуктов. 2 табл. ° эффективных доноров эшерихий группы

НйгН(ф ) гибриды шигелл Флекснера и эшерихий, проводят предварительное удаление клеточных липидов, лиофилизацию, суспендиров ание биомассы в дистиллированной Н О, многократное воднофенольное экстрагирование (2:1) с использованием свежеперегнанного фенола (температура экстракции 65—

700С) с последующим центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин), диализом в течение 3 сут через пергаментную бумаж3 1640165 а ную мембрану с размером пор 10-20А, . у дельной поверхностью пор 10001200 м /r и толщиной 0„16-0,20 мм, предварительно промытую хлороформ5 метанольной смесью (2:1) для обезжиривания, упаривания при 30 Я с использованием жидкого азота, ультрацентрифугированием в режиме: 108000g, 1 ч, три раза, с последующей лиофильной сушкой полученных продуктов.

Пример. Проводят генетическую рекомбинацию бактерий с использованием донора Е.co1i HfrB (Я ), (str- шоп, neo"), реципиента .

sh. flexneri Ф 737 тип 2а (str, шопэ, neo>) Получают половые гибриды (генетические рекомбинаты) шигелл Флекснера и зшерихий HfzH(Я ), три штамма:

R-737-2, R-737-4 и R-,737-6, которые 20 обладают одинаковыми биологическими характеристиками: грамотрицательным, неподвижны, устойчивы как к стрептоьицину, так и к антибиотикам резерва

) (str, mon, neo ), активны в отно- 35 Ф шении к лактозе, что используют вместе со стрептомицинрезистентностью как важный селективный признак для отбо1ра рекомбинантов. По вирулентности половые рекомбинаты следуют за реципи-у ентной культурой Sh. f1exneri Р 737 серотин 2а (LDso составляет 133Ь

+ 47 млн.микробных тел). Так как все три штамма рекомбинантов имеют близкие биологические характеристики, то для дальнейших исследований отбирают R-737-4, отличающийся наиболее высокой стабильностью морфотинкториальных н биохимических показателей.

Биомассу бактериальных культур выращивают на стандартных плотных средах МПА одной серии изготовления.

Отмыв культур от остатков среды производят раствором натрия хлорида с массовой долей 0,50Х до отрицатель- 45 ной реакции с нингидрином. Чистоту выросших колоний проверяют микроскопическим путем. Биомассу бактерий высушивают на воздухе. удаляют клеточные липиды.

Остаток биомассы лиофильно высушивают, делят на три равные части и

I суспендируют каждую в дистиллированной воде при 37 С, затем каждую пор" цию обрабатывают фенолводной смесью

55 (1: 2 V/V) с использованием свежеперегs

0 нанного фенола при 65-70 C(5 раз),полученные экстракты объединяют и центрифу гируют (3000 о б/мин) „диализ уют че ре з пергаментную бумажнр> мембрану с размером пор 10-20 А, удельной поверхностью пор 1000-1200 м /г и толщиной 0,16-0,2С мм, предварительно обезжиренную хлороформ-метанольной смесью (2:1) в течение 3 сут, меняя воду через каждые 6 ч, упаривают на ротЬрном испарителе с использованием жидкого азота (Т=ЗО С), полученные экстракты центрифугируют в следующем режиме: 108000s, 1 ч, 3 раза. Полученные продукты лиофилизуют. Выход рассчитывают по данным весового анализа.

Общая характеристика. состава АПС и их выхода у генетических рекомбинан гов и исходных культур донора и реципиента дано в табл.

Выход ЛПС наибольший у половых гибридов (табл. 1). ЛПС каждой из культур гидролизуют 17.-ной уксусной кислотой (50 мл, 2 ч. 100 С) в запаянных ампулах. Переосаждение липида А производят пятикратным объемом ацетона.

Липид А (10 мг) гидролизуют соляной кислотой (С (1/1 HC1)=4 моль/л;

12 ч; 100 С) в запаянных стеклянных ампулах. Жирные кислоты экстрагируют хлороформом с последующим упариванием и метилированием диазометаном. Проводят контроль чистоты фракции метиловых эфиров. Газожидкостную хроматографию проводят, используя хроматограф с пламенно-ионизационным детектором при условиях: колонка 0,5 см х 35 м., температура колонны 180 С, фаза Sp-1000. Хроматомасс"спектрометрию метиловых эфиров

ЖК ведут на приборе (колонка та же).

Осуществляют интерпретацию массспектров. Определяют общее содержание белка в ЛПС, нуклеиновых кислот, нейтральных моносахаридов фенолсерно кислым методом, находят содержание, кетодезоксиоктоновой кислоты (КДО), рассчйтывают массовую долю суммарного фосфора в ЛПС. Фенола в препаратах не обнаруживают.

Полученные данные статистически обрабатывают r, учетом распределения Стьюдента-Фишера.

После выхода пирогенной кривой на режим пирогенала производят сравнительное изучение действия ЛПС в зависимости от источника и дозы препарата. Данные статистически обра1640165 6 Формула изо бре тения

"Способ получения бактериального пирогена, предусматривающий экстракцию пирогена из бактерий с последующим диализом в течение 3 сут,. ультрацентрифугированием и лиофилизацией целевого продукта, о т J: и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, пироген экстрагируют из генетических рекомбинантов шигелл Флекснера н Esherichia coli HfrH(4 ) ЗЗУ.-ной воднофенольной смесью при 70 С после предварительного суспендирования в дистиллированной воде, а диализ осуществляют через обезжиренную пергаментную бумагу с размером пор 1020 А, удельной поверхностью пор 10001200 м /r и толщинои 0,16-0,20 мм со сменой диализной воды через 6 ч.

Таблиц а1

Содержание компонентов (М + m), Ж

Компонент

Г

Донор, Реципиент Sh. fexЕ.coli HfrH() ) . neri Ф 737 тип 2 а

Гене тиче ский ре комбинант

1, 82+0, 10

36,003.-1,49

1 49+0,21

21,00i-1,62

2,46+0 13

35,0 1,52

ЛПС

Липид А

МоносахаРиды

ИР

Белок

Нукле иновые кислоты

Фосфор

0 Ъ0,00 .

О, 00 0, 00

2э 79ЙОФ31

0,00+0,00

О,ОЪО,ОО

О, 00 0, 00

0,003:0,00

О,оао,оо

1,2Щ0,02

0,33+0 01

2,11+0,52

0,28+0,00

1,88 0,36

1,0Щ0,04

2,23 0,50

Таблица 2

Соде ржание (M+m) Е

Компонент

ХХТ(рекомбинант) Т (донор) II (реципиент) 1 1

I-III II-III

Жирные кислоты

Углеводы

ЗОН. С

43,70+0,50 37,80 0,45 21,20 0,40

55,8010,25 61,70 0,38 72,20+1,73

46,04+2,48 45,96+1,58 48,66+2,33

5 батывают с уче ом распределения

Стьюде н та-Фишера.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что половые гибриды являются более лучшими эндопродуцентами ЛПС, чем исходные эшерихии (в 2 раза) Е.co?i HfrH(9, ) и шигеллы. Средняя температура режима пирогенного эффекта у ЛПС гибридов составляет

40,5 С при 40,0 С у пирогенала.

Содержание жирных кислот и углеводов в липиде А генетических реком,бинантов и исходных культур-донора и реципиента приведено в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый способ получения бактериального пирогена является новым и на основании биотестирования обладает температурой и временной компонентой пирогенно ro эффекта, свидетельствующей о его усилении в сравнении с пироге налом.

Статистическая достоверность разл.

<О, 05 (0,05 < 0,05

<О 05 (0,05 с.0,05 ,.-0,001 с 0,001