Способ гибридизации дезоксирибонуклеиновых кислот

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для исследовательских и диагностических целей. Цель изобретения - упрощение способа Для достижения цели используют микропористые капроновые мембраны с размером пор 02 мкм производства завода Химфил р/к Хину Калур, на которые наносят анализируемую ДНК в растворе, содержащем 0-0,1 М NaCI или NH /Ас Мембраны облучают ультрафиолетом в дозе 0,6 - 0,8 кДж/м2 при длине волны 260 нм, и инкубируют в присутствии ДНК- зонда в растворе, содержащем 0,5% SDS.

С0103 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ CCCP) . к лвторСкоМУ свидкткяьСтву (21) 4619400/13 (22) 12.12.88 (46) 30.12.93 Бюл. Иг 47-48 (71) Институт цитологии и генетики СО AH СССР (72) Калачиков С.М„Дымшиц М; Адаричев ВА;

Салганик Р.И. (54) СПОСОБ ГИБРИДИЗАЦИИ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛБИНОВЫХ КИСЛОТ (57) Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано дпя исследовательских и диагностических целей. Цель (19) SU (и) 16409 95 (51) 5 COVH21 00 С12Я 1/б"1 изобретения — упрощение способа. Для достижения цели используют микропористые капроновые мембраны с размером пор 0,2 мкм производства завода "Химфил" р/к "Хину Калур", на которые наносят анализируемую ДНК в оастворе, содержащем

0 — 0,1 М NaCI или NH /Ас Мембраны облучают

4 ультрафиолетом в дозе 0,6- 0,8 кДж/м при длине г волны 260 нм, и инкубируют в присутствии ДНКзонда в растворе, содержащем 0,5% S0S.

1640995 (56) Anal, Biochdm„1984. 138, р. 267-284, Формула изобретения да, отличающийся тем. что, с целью упрощения способа, ДНК наносят на капСПОСОБ ГИБРИдИЗАцИИ Д ЗОКСИ- роновь е мембраны c paa epoM nap 0,2

РИБОНУКЛЕИНОЦЫХ КИСдОТ, включаю- мкм в О.- 0,1 M растворе ЙаС! или МНлАс, щий нанесение денатурированной дйК на облучают ультрафиолетом ь дозе 0;6 - 0,8 микропористые капроновые мембраны, ин- кДж/м при длине волны 60 нм, а инкуба50 кубацию мембран в присутствии дНК-эон цию осуществляют в присутствии 0,5%

SDS, Составитель Т. Забойкина

Редактор Н. Тимонина Техред M. Моргентал Корректор E. Папп

Заказ 3470

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Изобретение относится к области моле(улярной биологии и может быть использовано для исследовательских и диагностических целей.

Целью изобретения является упрощение способа.

Для достижения цели используют микропористые капроновые мембраны производства завода "Химфил" р/к "Хийу Калур" с размером пор 0,2 мкм, на которые наносят анализируемую ДНК в растворе, содержащем 0 — 0,1 М NaCI или NH4Ac. Мебраны облучают ультрафиолетом в дозе 0,6 — 0,8 кДж/м при длине волны 260 нм, и инкубируют в присутствии ДНК-зонда в растворе, содержащем 0,5, Ю$.

Пример 1. ДНК фага Аразводят дистиллированной водой о концентраций

5000; 2500; 1250; 625. 312,5; 156,25; 78,125;

39; 19; 9,76; 4,88: 2,4 пг/мкл; в объеме 100 мкл денатурируют нагреванием до 100 С в течение 7 минут, быстра охлаждают во льду и наносят по 1 мкл каждого разведения на влажную капроновую мембрану, с размером пор 0,2 мкм производства завода "Химфил" р/к "Хийу Калур", уложенную на стопку из двух листов фильтровальной бумаги, смоченных дистиллированной водой. Затем влажную мембрану облучают под четырьмя ртутными лампами низкого давления с расстояния 17 см в течение 15 секунд при А =

=260 нм (0,6 кДж/м ).

Поедгибридиэацию капроновой мембраны с иммобилизованной ДНК проводят при 42 С 1 ч в буфере, содержащем 100 мМ трис-HCI рН 8,0, 50% формамид, 10% декстрансульфат, 4xSSC, 0.5% SDS. Ha 1 см фильтрата берут 260 мкл указанного раствора. Через 1 час добавляют радиактивно меченный зонд до концентрации 1,7 10 срм/мгпи проводят гибридизацию 16 ч при

42 С, отмывают в двух сменах по 100 мл раствора, содержащего 1 х $$С и 0,5% SDS, по 20 минут при 65 С и споласкивают 2 раза в 1х$ЯС, затем в воде.

Мембрану экспонируют с рентгено5 вской пленкой и усиливающим экраном одновременно с калибровочными разделениями радиоактивно меченной

ДНК, иммобилизованной на капроновой мембране. Оптическую плотность авторади10 ографа с мембраны с гибридизацией определяют на денситометре и сравнивают с оптической плотностью калибровочного авторадиографа, по которому определяют количество сгибридиэовавшейся

15 радиоактивно меченной ДНК.

Чувствительность способа, т,е. минимальное количество специфической ДНК, определяемой в образце данным способом, составляет 0,1 — 0.5 пг ДНК мишени при ис20 пользовании ДНК зондов, меченых до удельной активности 5 х 10 — 10 импlмкг мин.

Таким образом, данное изобретение позволяет повысить эффективность .способа гибридизации деэоксирибонуклеиновых

25 кислот, а кроме того, использование в качестве гибридизационных фильтров микропористых капроновых мембран производства завода "Химфил" р/к "Хийу Калур" позволяет расширить ассортимент микропористых мембран, которые могут быть использованы для иммобилизации ДНК, обеспечить возможность в ряде случаев замены дорогостоящих импортных нитрацеллюлозных или капроновых мембран на отечественные, получить значительный экономический эффект в экономии валюты, упростить процедуру и сократить время иммобилизации

ДНК за счет перехода от эапекания в вакууме в течение 2 ч к облучению ультрафиоле40 том в течение 20 с,