Способ получения лошадиного @ - и @ -интерферона

 

Изобретение относится к биотехнологии . Получают ген-библиотеку ДНК, ткани печени лошади, осуществляют скрининг с помощью радиоактивно мар кированных генов человека с выделением гомологенных последовательностей , клонируют к ДНК в случае Oi-интерферона в вектор pUC 9 с последую щим реклонированием к ДНК в вектор, parp ATER 103 и pBR 322 с получением экспрессионных плазмид, в случае ft-интерферона клонируют к ДНК в вектор pUC9, реклонируют фрагмент к ДНК, кодирующий -интерферон в плаэмиду parpATER 103 и конструированием экспрессионной плазмиды рАН62, полученные плазмиды экспрессии трансформируют в штамм бактерий E.coli IM 101, трансформанты культивируют с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 2 з.п. , 1 табл.

А3

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК,.SU„„

Р1)У С 12 N 15/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATFHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3994213/13 (22) 1 7 ° 12 ° 85 (31) P 3446122.1 (32) 18 12 ° 84 (33) ЭЕ (46) 15 ° 04,91, Бюл lit 14 (71) Берингер Ингельгейм Интернациональ ГмбХ (DE) (72) Адольф Гиммлер, Рудольф Гаупч манн (AT) Норберт Гауэль (DE)

1юнтер Адольф и Петер Светлы (AT) (53) 575 ° 224„2 ° 577 ° 2(048)(088,8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛОШАДИНОГО 0Си Р ИНТЕРФЕРОНА (57) Изобретение относится к биотехнологии» Получают ген библиотеку ДНК, ткани печени лошади, осуществляют

Изобретение относится к биотехно» логииа

Способ получения лошадиного 06 ц 3-интерферона заключается в том, шло ткань печени лошади инкубируют в присутствии буфера, рН 8,0, экстрагируют ДНК с использованием фенола пиализом и осаждением ДНК этанолом, полученную ДНК центрифугируют при

40000 об/мин в буфере, рН 8,0, диапизуют и осаждают этанолом ДНК длиной более 50 кЬ, (пар оснований), кото рую подвергают частичному перевари ванию эндонуклеазой Sau ЗА в присутствии буфера, рН 7,5, полученные фрагменты фракционируют путем элект рофореза, выделяют фрагменты длиной

10 23.к,Ь,, которые после дефосфори. лирования клонируют в векторе

2 скрининг с помощью радиоактивно маркированных генов человека с выделе» нием гомологенных последовательностей, клонируют к ДНК в случае М-ин терферона в вектор pUC 9 с последукг. .щим реклонированием к ДНК в вектор.

parp ATER 103 и pBR 322 с получением экспрессионных плазмид, в случае

-интерферона клонируют к ДНК в век тор pUC9, реклонируют фрагмент к ДНК, кодирующий Р -интерферон в плаз миду

parpATER 103 и конструированием экс пресснонной плазмиды рАН62, полученные плазмиды экспрессии трансформируют в штамм бактерий Е.coli IM 101, т ран сфо рманты кул ьти виру ют с по сле- ф дующим выделением и очисткой целевого продукта, 2 з,п. фг.лы, 1 табл

ЕМВ1.3(-3А), полученную ген-библиоте ку ДНК подвергают скринингу с помо» щью радиоактивно маркированных ин терфероновых генов .человека с выде лением гомологичных по следовательно с тей, при этом для получения и, ан терферона Hind III-фрагмент клона

Eg-М1 лигируют с гидролизованным с помощью SmaI и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерии

Escherichia co1i IM 101и отбирают устойчивые к ампицнллину клоны, содер™ Ф жащие ппазмиду рАН50, далее плазмиду (,Ц рАН50 обрабатывают Hind III-эндонук» леазой и лигируют с обработанными полинуклеотидкиназой ЯрЫ; связ ками, получают плазмиду рАН51, плазмиду рАН50 гидролизуют PvuII, лигируют

16429 олигону клеотидом 5 -TGTGACC TGCCTCAC, который предварительно обрабатывают полинуклеотидкиназой, денатурируют

ДНК кипячением, удлиняют олигонуклеотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии, dATP, dGTP, dCTP и dTTP, удаляют 3 -выступ инкуб ацией с Т4-ДНК-полимеразой в при сутстнии dATP, dGTP, dCTP и 10

dTTP, далее фрагмент лигируют с олигонуклеотидами, 12-мером

5 -AGCTTAAAGATG и 8-мером 5 -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндо» нуклеазами Hind III u Bgl II пол - 15 ченный фрагмент длиной 190 к Ь. лиги руют с гидролизованным Hind III u

Bgl II вектором рАН51, полученную плазмиду pAH51/2 режут Sph I u

Hind III и лигируют с Hind III 20

Sph I или Hind III — Вапй. I фрагментом плазмиды parpATER 103 с получением экспрессионной плазмиды рАН52 или рАН 52/2, или плазмчду рАН52 гидролизуют эндонуклеазами Sph I и 25

EcoRI, затупляют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова в присутствии

dATP, dGTP, dCTP и dTTP, получают

ДНК длиной 1,1.к Ь,, плазмиду pBR 322 переваривают с помощью Pvu II u 30

EcoRI затупляют концы ДНК с помощью фрагмента Кленова и дефосфорилируют с получением ДНК длиной 2,4 к,Ь,, которую лигируют с ДНК длиной 1,1 к.b. с получением экспрессионной плазмиды

35 рАН53, для получения Р «интерферона

Рчи II-фрагмент отобранного клона

Eg- 6, лигируют с гидролизованным с помощью Sma I и дефосфорилированным вектором pUC9, полученными рекомби- 40 нантными ДНК трансформируют бактерии

E,coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рЯ160, затем плазмиду рАН60 об рабатывают Hgi Al-эндонуклеазой и 45 после выпрямления 3 -выступаяцих концов ДНК с помощью Т4 дНК полимеразы тупые концы лигируют с обработанными полинуклеотидкиназой Sph 1-связками, полученную ДНК режут Sph I u Hind III,50 полученный фрагмент длиной 1,85;к,Ь, лигируют с разрезанной Hind III u

SphI плазмидой parpATER 103, получен. ° ную плазмиду рАН61 режут ВапН? и

SalI с получением фрагмента длиной

1,3 к,Ь., который лигируют с перева ренной BamHI u SalI N13mp9-фаговой

1 . ДНК, полученную однонитевую ДНК лигируют с оли гонуклеотидом

56

5 GTGAACTATGACTTG который пРедваРительно обрабатывают полинуклеотидки назой, денатурируют ДНК кипячением, удлиняют олигонуклеотидную з атравку с помощью фрагмента Кпенова в присут» ствии dATP, dGTP, dCTP u dTTP и по» лученную ДНК осаждают, оставшиеся однонитевые участки ДНК переваривают с помощью 81-нуклеазы и полученную ДНК с тупыми концами лигируют с олигонуклеотидами, 12-мером 5 »AGCTTAAAGATG и 8-мером 5 -САТСТТТА, полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазами Hind III и SphI полученный фрагмент дпиной

1>1 к,Ь. лигируют с Hind II — SphI фрагментом parpATER 103 с получением экспрессионной плазмиды рАН62, полу" ченными экспрессионными плазмидами трансформируют штамм бактерии: Е, со1 IN 101 и трансформанты культивируют с последующим выделением и очисткой конечного продукта, 1

Пример 1 ° Получение экспрессионных плазмид рАН52, рАН52/2 и рАН53, Стадия А Выделение лошадиной ДНК.

Замороженную ткань печени лошади размалывают в жидком азоте до порош» ка и в течение 3 ч при 55 С инкубируют в 0,5 M этилендинитрилтетра уксусной кислоты (ЭДТА), 10 MM трисНС1, рН 8,0, .0,5Х додецилсульфата натрия (ДСН), 0,1 мг/мл протеиназы К (20 мл/г ткани), Полученный вязкий раствор освобождают от белка путем экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлоро» формом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), диализуют про» тив буфера 50 MN трис-НС1, рН 8,0, 10 мИ ЭДТА и 10 мМ хлористого натрия, ДНК осаждают двумя объемами этанола После полного высушивания в вакууме ДНК растворяют в ТЕ-буфере (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мй ЭДТА) при 4 С и вместе с хлористым цезием о в количестве 1,273 г/мп раствора центрифугируют в течение 62 ч при

20 С со скоростью 40000 об/мин Пос ле полного удаления СвС1- градиента содержащие ДНК фракции диализуют против ТЕ-буфера, затем ДНК осаждают двумя объемами этанола, промывают

70 -ным этанолом, высушивают и сно« ва растворяют в ТЕ буфере (4 С) .

Готовый ДНК-препарат свободен от

PHK и имеет длину более 50 к Ь., что

1642956

55 определено путем электрофореза на

0,45 »ном агаровом геле

Стадия: Б, Частичное переваривание эндонуклеазой и фракционирование по размерам лошадиной ДНК, 50 мкг лошадиной ДНК двукратно ингибируют при 37 С с 1,6 ед ° Sau3A в 450 мкл реакционной среды (10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ хлористого магния, 1 мИ дитиотрейтола) ° Спустя

l5, 25 и 40 мин отбирают .по 150 мп раствора и смешивают с 15 MM ЭДТА и путем нагревания в течение 10 мин при 70 С прекращают реакцию, После о добавления 0,3 М ацетата натрия, рН 6,0, ДНК осаждают с помощью

2,5 объемов этанола, После повторного растворения в ТЕ-буфере ДНК разделяют по величине путем электрофореза в течение ночи на 0,45Х-ном агаровом геле в ТВЕ буфере (10,8 г/л трис, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л На ЭДТА) примерно при

1 В/см с использованием маркеров величины (переваренная с помощью

EcoRI u Hind III и с помощью Hind Ш лямбда-ДНК) вырезают ДНК длиной 1023: к,b., ДНК электроэлюируют в течение 3 ч при 300 В (буфер О, lхТВЕ), очищают на колонке Элютип и дефосфорилируют следующим образом.

ДНК инкубируют в течение 30 мин при 37 С в 140 мкл реакционной среды (50 MM трис-НС1, рН 9,5, 10 ммоль хлористого магния, 0,1 MM ацетата цинка, 1 ммоль спермидина) вместе с

5 ед, кишечной фосфатазы крупного ро гато го ско та, доб авля ют сл едукщие

5 ед фермента и инкубируют 30 мин, После добавления ЭДТА до конечной концентрации 25 мМ ДНК экстрагируют однократно смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), двукратно смесью хлороформа с изоамиповым спиртом (24:1 по объему) и трехкратно диэтиловым эфиром, осаждают этанолом, высушивают и растворяют в О, 1хТЕ-буфере .Стадия В, Построение лошадиной ген библиотеки ДНК»

Дефосфорилиро ванные длиной ) 023: к,b. фрагменты лошадиной ДНК клонируют в лямбда-векторе, лямбдаЕИВ13 (или-ЗА), с тупы я G-А-Т Сконцами, полученными путем удаления внутреннего BamHI-фрагмента фаговой

ДН Кб

8 мкг фрагмента EMBL-3A лигируют примерно с 5 мкг фрагментов длиной

10-23 к,Ъ. лошадиной ДНК длиной 10

23. к.b. в присутствии 10 ед Т4-ДНК лигазы, инкубируют в течение. ночи при 14 С и один день при 4 С в

50 мкл реакционной среды (66 мМ триc-HCl рН 7,2, 0,1 М хлористого натрия, 10 мМ хлористого. магния, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ АТФ) . Продукт лигирования упаковывают в зрелые фаговые частицы с использованием in vitro лямбда упаковывающей системы °

Компоненты этой системы, т е, ультразвуковой экстракт (УЭ), лизат, получаемый путем замораживания-размораживания (ЛЗР), буферы Ml и А, приготавливают известным способом

10 мкл продукта лигирования в тече» ние 2 мин инкубируют при комнатной температуре вместе с 25 мкл УЭ, ко» торый так же,как и JDP, в течение

30 мин инкубируют во льду, смешивают с 100 мкл ЛЗР и инкубируют далее в течение 60 мин при комнатной тем" пературе, Смесь разбавляют 150 мкл лямбда-разбавителя (100 мМ трисНС1, рН 7 5, 10 мМ "сульфата магния, l uM

ЭДТА) и хранят при 4 С

Часть упакованных лямбда фагов титруют на Е.coli NM 528 SupF. В целом получают примерно 1 л10 неза висимых лошадиных рекомбинантных

ДНК Остаток упакованного материала . размножают путем нанесения на содер жащие штамм NM 528 и сульфат магния

LB-агаровые пластины плотностью

30000 пятнообразующих единиц на

13,5 см пластины

Стадия Г, Скрининг лошадиной генбиблиотеки, По 10 мкг высокомолекулярной ло шадиной ДНК полностью переваривают с помощью EcoRI (Hind III), путем электрофореза разделяют в 0,8Жиом агаровом геле и переносят на нитро целлюлозные фильтры, Hind III-фраг мент плазмиды pER33 длиной 845:к,Ь., который содержит всю кодирующую бе лок область для зрелого человеческо го ф,-2APG-интерферона получают мар кированную Р»32 ДНК

Ни троцеллюлозные фильтры предварительно гибридизируют в течение

7 ч при 65 С в 5>SSPE (0,9 М хлорис того натрия, 50 мМ гидрогенфосфа а

1642956 натрия, 5 MM ЭДТА, рН 7,4), 5» раст- вор .Денхардта (О, 1Х Фиколла, О, 1Х поливииилпирролидона, О, l альбумина, сыворотки крупного рогатого скота), О, l . ДСН, 20 мг/мп ДНК из спермы ло сося и затем гибридиэируют .в таком же растворе, но без ДНК из спермы лосося, с использованием 13 ° 106 cpm маркированной пробы, После инкубации при 65ОС в течение ночи фильтры промывают четырехкратно в течение 1l,5 ч в 3xSSC (0,45 M NaC1, 45 мМ цитрата натрия), О, l . ДСН при 65 С и экспонируют в течение 7 дней на рентгеновской пленке фирмы "Кодак" с помощью усиливающих пленок фирмы

"Кодак" » Появление нескольких полос доказывает наличие семейства интерфероновых генов у лошадей, как ovo было ранее обнаружено у крупного ро» гатого скота, свиней и у человека, Поэтому для скрининга генов интер ферона в библиотеке лошадиных ДНК применяются такие же условия гибри» дизации

600000 рекомбинантных лямбда-фа гов наносят на содержащие штамм

Е.coli БИ 528 пластины плотностью

30000 пятнообразующих единиц на

13,5 см пластины, Четырехкратные нитроцеллюлозные реплики готовят с каждой пластины После высушивания о в течение 2 ч при 80 С фильтры про о мывают в течение 1,5 ч при 65 С в

1 М хлористого натрия, 10 мМ трисНС1, рН. 8,0, О, l ДСН, предваритель» но гибррдизируют в течение ночи и по 2 реплики каждой пластины гибридизируют в течение 24 ч с использова нием на 1 Фильтр 1,5х10 cpm пробы

6 радиоактивного Ы-инте рферона, После трехкратно повторенного скрининга получают 8 клонов лошадиного -интерферона, которые дают положитель ные сигналы гибридизации

Стадия Д Характеристика реком бинантных фагов, 1

Из 7 гибридизирующихся с челове» ческим О(-интерфероном рекомбинантных

ДНК готовят фаговую ДНК ДНК перева ривают рестриктазами EcoRI, BamHI, Hind III, PstI, BglII, Sa1I, SmaI u путем электрофореза разделяют в

0,8Х-ном агаровом геле» Величина гибридиризукицих фрагментов определя« ется по способу Саусерна, Положение рестрикционных мест внутри лямбда« вставки определяют после частичного рестрикционного переваривания ляибдаЦНК, маркировки правых или левых тупых концов лямбда-ветвей синтетичес5 кими, маркированными Р 32 олигонук» леотидами и электрофореза в 0,45Хном агаровом геле»

Стадия Е, Субклонирование гена лошадиного06-интерферона, Рестрикционный фрагмент клона

Eg-0L1, который гибридизуется с мар» кером человеческого С -интерферона, субклонируют в векторе pUC9 плазми» ды pBR322. Вставка чужого ДНК-Фраг» мента приводит к прерыванию lас на -галактозидазы и таким образом изменяет фенотип тр ан сфор миро ванного плазмидой штамма Е.coli IN 101 от

1ас до lас . Колонии бактерий с фе нотипом lас — отбирают по белой окраске.

Hind III-фрагмент длиной 3,2 к.b. из клона Eg- ;1 элюируют из агаро»

25 вого геля, очищают на колонке Элютип Д, лигируют с 40 нг разрезанного с помощью SlaI и дефосфорилированного вектора pUC9 в примерно 10-кратном малярном избытке, трансформируют в Е.coli IN 101 и наносят íà LB-топагар с 0,2- мг/мл БХИГ (5»бром»4» хлор-3-и ндолил-/ -17 гала кто зид), 0,17 мг/мл ИПТГ (изопропилтиогалактозид) и 0,1 мг/мл ампициллина, Белые колонии выращивают в 5 мл LB-бульона с 0,1 мг/мп ампициллина в течение ночи при 37 С с последующим скринингом, Полученную при этом ллазмиду обозначают как рАН50»

Стадия Ж, ДНК-последовательность гена лошадиного OC-интерферона из клона Eg- 1, Hind III-вставку плазмиды рАН50 длиной 3,2 к,Ъ. подвергают анализу

45 последовательностей по методу Сангера» 50 мкг плазмидной ДНК из рАН50 полностью переваривают рестриктазой

Hind III, фрагмент длиной 3,2 к,Ь., выделяют из l Х ного агарового геля и очищают» 15 мкг этого фрагмента в

1 100 мкл среды лигирования лигируют

1 с 14 ед ° Т4-ДНК-лигазы при 14 С в течение ночи и затем при 4 С следук . щне 4 дня» Лигированную ДНК фрагмен55 тируют с помощью ультразвука импуль сами в 20 с в течение 140 с в ледя ной бане, ДНК фрагменты в течение

2 ч при 14 С в 250 мкл реакционной среды (50 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ

l0!

64295о

v.;:". туа "м цт та«л тсл ! Спм1стт Всл819Ф лаала848146п тасА".! !!С!11 IT

1 ПСТААВ!а!6448!ЩБ11АЕЕСЛЕЕВТЕСАСАРг г ЕАТА!АССВТА!ЛТ!815!ТАС!46ППСТ164888СТТСЛЛПРЕЕАЮЯТСТМЛ -гЩТСТВВСАВ««6 tel

8488СА4ТЬ С}ЛСУ4СЕАСЛЛААТАТВВТС ИЕ; СЛС!ЕСССТЛС4КСС«СА!ЕЛ! ЕЛ ТСТАС 1!СЯТЛТФЫ4ЛЕСаСЛ !АМЕ A Тайв«14СЛЕАЛВТЛВАЛУ6144888М Sej аслтесАЕгма!88улсстАВТтссстатпм8асасат8сасааае8м881спслеаеласссжосслаеестслсжВте сссассАВСАВСА!Ст8слл8атсссса ц!

-Ч -tS -}a -5 l 3

}tet 41г Lee !re Уг! Ser Lee Lee Aet Ba Lee Уг! Tal Lee ter Сую }}}S Ser Иг Суе ЕгГ Lee 61у(ЯИА Lee Era }tta Thr }tta

4!6 Вст стВ сст Вп 1сс !та стВ Afe Icc cfe Втб OTO с!с Аес ТВС сас !Сс аус Тес tcf cfe 884 161 6 с с16 сст chc асс сат Я4

t0 l5 20 16 SÔ ТВ

«er }гг 8}у Ase Tht |г9 Уа! Les }Тг! Lee Lee ВТу 81» Art kt аг5 lie Ser Pre Phe Ser ß .ге Lfs ага art Ass азг )he 81у

А8С С19 68С АХ АСА 488 61C ffe 419 СТС CTO 886 СЛЛ А!8 АЕЕ ФИ ATC Тсс Ссс Пс TCC ТВС СТВ М Вас AQ АА1 OAC TTT 861 104 га IS SÔ 55 49 И

Pht tre Stn 8le уг! fhe ага 61Т Ass 81 ° the аг9 1уг rrs Sls а}г lle м аlа sa} Hts 81е Thr !1 ° Ole. 81г иe рае ч}1 Lee пс ссс с48 зйв 616 Tff Qc 88c Алс 0}6 ттс с66 м6 ссТ.СЛА Всс атс тс7 6с6 В!с clt 846 ас6 Atc саа са6 Afc пс слс стс ау!

19 13 99 33 S9 5

the Ser Thr is@ 6!у Sar Ser 4!а Ata ТгВ Ага Ole Ser Lee Lee tsa Lfs Lee Tfr Thr 6!у Lee Tfr Ha 614 Lee Thr Be Lee 81г

17с l6c ЛСА ю ВВс ft fcf Occ Всс та Влс 646 46с стс cti Qc а}п стс TAc Acf 6Q стс fif cAO cle п6 лст ое ст6 Вла 16I

t99 !93 ПВ 1 l3 !ГФ tÈ

А!ЛЯLee.Ser Ole В!а уг! 61г eat 8! ° Ote fhr P e Lae Aet Asa Ote Ast} Ser Leo Ем 414 }}al Ar9 Are Tfr РЪг 81г Are lie

6tX 16t СТВ 46с Q4 Or4 616 886 ВТВ 94 94 ЛСЗ ССС СТВ 419 МС 846 84C TCC CTO CTS Ес; 616 488 ЛВА ТАС ПС СЛА 484 Цс 916

t:4 . ЯЗ Тй . I IS tA !Я

Ata Lee TTr Lee 61e Be LTs LTs TTr Ser аГАЯА!г Tra Яе Иг Уг! Аг9 414 Ца Иг }tet ArI Ser The 3» Ser Ser Ъ |м

6СТ СТС fif СТВ CAI Qe аа6 Ааа TAC 46С ССТ 161 OCC 166 ВАЗ АТС ВТС АВА ВСЛ 94 ATC 418 AQ TCC ПС ТСТ TCI ТСС АСА Лас ФЙЛ

li9

Lee У} а Ole Ве + пз сс6 che Aef тла 66488ААВлалтбаслсст86ттсласлте5лаатбсттстслпбастВАТАА!АтслслсттсслсттВстстВССАТсТСААВВАСТОслт87ст TOTO млВТААтит6асст8лАпВлАтсААпптсААаТ6пттсАВтА8тапА4т8мт6п6е6тстАассст6т86аслпАВтст8АтуслВАСВАСС41611841статпаут 1!Уу Атплптлслтаптапталутаптат648аптааапауппВпВстауаасаттат618слсстпаслст6!АВТттаауатааслааат81418спсатлптАВсс д!а Апуапапттс161811САТТ;ла!Ст!ТАСТВТАВААААТАТСПСТАПТВПТАПСтпаалаЕАЕАЛ:САССлСАСС184616!ВСААВСТВАТтлла5441864188С }! AD

Гаттсаутт}кслтслу!6тслТлттсАаВтта6лаетамма8асттсстстал6сст88тт6т4тВпеасстсл8ыТлТ8л88т8ллслсллсаФаТаса8тусстбстттсТ }Яг

T9A4T9fTT6tff TTTCT8688AA88tAACCTAAAAACACT4ACCAAfT84TT66TAATT6AATATTМПЛЩПа»1ТаАсАсТЛАПа4ТаТТЛ8МаПа!Та!САВТТАВВТ !буЗ

} ТААТЕС!ЛЛЛ!ВВЕЛЛАВЗЛААЛАМ!ВВЛВТВСАЛМТВТССХТВВАТАПСВЛВПТВСЛАТПАСМБСЛЛТ !ССЛТВЛЛСТВТФВВТВВЫНТЕ»8! 46БАЛ!ЕВАЛВТВВТС tff >

44168ВЛЛЕЛЕз» ВАЛ ЕААТВЛЕААААВВЛС! ТЛЛААПЕА ТЕС !АЕЕЛСС ПСЛАССПАЯАЕ884488АСААВССА ТМ ВЕЛАЛСЛ861364416асса Л! В !ААСЛВВА I f t t

848ажллтебтеаелплсслТВТпаа88ллттаалсТВстуабллеастсаАТ67211са!Влалла18!88л!ейлллсТВссслсслжт868 «}488лелЕсВслтт86с жФ хлористого магния, 1 м11 дитиотреито-. ла, 0,5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота, по 0,1 м11

dATP, dCTP, dCTP, dTTP) обрабатывают

15 ед. б ольшо го фрагмент а и олиме разы-1 иэ Е.coli (фрагмент Кленова), После концентриро вания путем осаждения этанолом ДНК разделяют в 1Х-ном агаровом геле и ДНК-фрагменты длиной 10

0,35-1,0 к.b. выделяют и очищают

Примерно в 10 кратном молярном избыт» ке фрагменты лигируют с разрезанной рестриктаэой Smal и дефосфорилированной репликативной формой бактериофага Mt 3mp8 и трансформируют Е.coli

IM 101 ° Однонитевую ДНК полученного рекомбинантного фага выделяют и пос ле связывания с одним синтетическим. олигонуклеотидом осуществляют синтез второй нити в четырех отдельных реакциях с использованием фрагмента

Кленова ДНК»полимеразьг 1 из Е.coli.

Ниже приводятся нуклеотидная

Ньпй III-вставки плазмиды рАН50, аминокислотная и полная нуклеотидная последовательности Ед-ф;интерферона, 12

1642 956

6АСсТсА6ж6А6СТА616Т6616БААПСАссАССА6ААА6САСАсТа6А61А6БА66ААА66Т6ААТААыААБТТААТ6АСААТАТАТА.ААААТ.ВТТТТБАБ.С(11 ТВС(1

ТСТ-"-ТАБАБ- АБЗАБАБСААТААББ(АВБАССТАБААТАБЛВТБТББАТТАПТПТСТСТВСАТ(6!ТПСС(111111иААТ:САСП*С С ББА

Т ИБСТТСТББАТАВАТТТСА(66(ПТВАТ

ТТАа

ВТАТТБАСАААТCAТАТТААТАТБТТТААТБТТТТАТТТКТТТАААТСАТВАААТАТ ITAATTA(TT I6AT 111АТСАТТАТ АБД АБ Ас

"t lA1 АТТАТТТАБАТТАЯТАСТАТБТТВААТБ{САБТБВ

° Ю ° ° f а ° ° ° °

6 Т *1 1 фл. 1 ему («С»(ТАСАСБ ХААА(АААТББАА(:БАС(ТТАБТБАБАБС, АБТТТББТБцвеСТЛАа 66&ъо сюА(ыесюе 166езаовйз Ь е яа! А;А

"(Т(САТ -1(АТТТТ:(1(АД!616 6(ТСАСТТТА111(161".АТ(ЯТАТТ(АБА(СТА(л, ТАI C.С(11116(. CA ((ю Т 1 . Т Т f((ATF.aAAI6(f4iаА!АЯТТТ

1 (1666 6(16»АББВАББАААСААБТВЛТВТАТТБААААТВАТВВ»АА ААТАБ(АСАБВТ(1(ТТААБТТТС(АТТПТАСТТС".СТАТТТТВВТАСТААС(1(ААБАТБАА

АТАБЗбБВТААТТСАВАТВСАБ(ААВАСААСТСТТВ(СААВБАЯМТАСТ(ГМИААААТБААСАТКА:ААТБАТАААААСС ТБАААСТАВТМАХААЖЛББ(»6111(СТВТ;ЗБ

ААСАССАСМ46САБТС1САСТБ1(сТАОПСТТ(АсТБТ6А6А16Р6АААБАТ6ААССТА6И(1СТ6Т6 ААА16ТАСТБАСАИТААТ(ТАБВВАТБАПМТТУААТСПБА ТТЮ2

ВТААТТАТ . АТБТТСТАТБТБТ ТО(БАТАБСАТАБТБААСААБАТАТАБМ„СТ 11(1(СТБАБААББТТ ТСТ 1 БССАААСАББТСТМТАБАТС."АТ ТИР с А:АММ4ТСЗИ 1(1

А6%1:АББ(мТ((Тса(ТБА(АТБ(ьжАААБАБББСААААБ."БАБ(1(уьБАТСАЮБАБ»АТТТТВТТ(ТТАВоаААБААоСТАТПА(АТААБТСТААБТТТААСААТ,А Тт2ф

Ти: ff 1(СТ(АТТТ:АА:.БС;1

50

Стадия Ki Конструкция экспрес» сионных плазмид рАН52, pAH52/2, рАН53а

20 мкг плазмиды рАН50 (см ста» дию Е) переваривают с помощью 30 ед, Hind III и ДНК-фрагмент длиной

4,2 кЬ., который содержит весь ген Я1 интерферона, выделяют из агарового геля с помощью ДЕ81 бумаги 30 и очищают, Для этого после разделения ДНК-фрагментов в агаровом геле перед и после выделяемой ДНК-полосы вырезают щель, в которую вставляют полосу ДЕ81-бумаги, Электрофорез продолжают до тех пор, пока желаемый ДНК-фрагмент полностью не будет связан с передней полосой бумаги

Задняя полоса предотвращает загряз некие более крупными фрагментами ДНК, ! 40

ДЕ81»бумагу со связ анным ДНК-фрагментом промывают дважды в течение

5 мин в 400 мкл буфера с низким со держанием соли (0,2 M хлористого натрия, 25 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 ьИ

ЭДТА) и затем ДНК дважды в течение

10 мин элюируют с бумаги ДЕ81 с по мощью 200 мкл буфера с высоким содер жанием соли (! М хлористого натрия, 25 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и осаждают 1 мп этанола. Концы

Hind III-фрагмента снабжают связками

SphI. Для этого 0,2 мкг связки SphI вместе с 2 ед, полинуклеотидкиназы инкубируют в 10 мкл реакционной среды в течение 45 мин при 37 С (70 мМ о 55 три с-НС1, рН 7, 6, 10 мМ хлори сто ro магния, 1 мМ АТФ, 5 мМ дитиотреитола).

SphI-связки лигируют с Нind IIIфрагментом с помощью 8 ед, Т4-ДНК-лигазы в течение 20 ч при 4 С. Затем фрагмент инактивируют при 70 С и ДНК переваривают с помощью 30 ед Sphl в. общем объеме 100 мкл, экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом, ДНК лигируют и трансформируют Е.coli НВ 101, Получаемую плазмиду обозначают как рАН51» Она содержит ген (41-интерферона с укороченной 3 -нетранслиро ванной областью и дополнительным SphI-местом разреза, Для того, чтобы встроить ДНК» последовательность зрелого лошадиного ф, -антерферона на нужном расстоянии от последовательности промотора, используют ДНК фрагмент длиной 0,4 к,Ь. который выделяют из 200 мкг разрезанной PvuII плазмиды рАН50, 1 нмоль синтетического 1,5-мерного оли гонуклеотида с последовательностью

5 -TGTGACCTGCCTCAC обрабатывают полинуклеотидкиназой, Он содержит поопе довательность, которая кодирует пер в те 5 аминокислот зрелого Df.t-èнтерферона из клона рАН50, 15-мер смеши вают примерно с 7 пмоль PvuII-фрагмента длиной 0,4.к,Ь. и в общем объе ме 34 мкл кипятят в течение 5 мин, чтобы денатурировать двунитевую ДНК, После охлаждения связанную с одной. нитью олигонуклеотидную затравку в

70 мкл реакционной среды (50 мМ трис

НС1, рН 7,2, 10 мМ сульфата магния, 0,1 MM дитиотреитола, 50 мкг/мл anbбумнна сыворотки крупного рогатого скота, 1 мМ dATP, dGPT, dCTP, dTTP) удлиняют с помощью 30 ед фрагмента

1642956

Полученную после трансформации

E.coli НВ 101 экспрессионную плаз» миду обозначают как pAH52 ° Она содержит все необходимые для индуцируемой экспрессии зрелого лошадиного ф,1-интерферона информации, Аналогичным образом из разрезанной Hind III и Bam HI ппазмиды parpATER!03 полу«

55 чают экспрессионную плазмиду pAH52/2 °

Эта экспрессионная плазмида примерно на 0,2 к Ъ. длиннее, чем рАН52, и

Кленова в течение 3 ч при 37 С. Для удаления возможного 3 - выступа ДНК

t затем инкубируют вместе с 16 ед, Т4-ДНК-полимеразы в течение 20 мин

5 при 37 С в !20 мкл реакционной среды (33 мМ трис-ацетата, рН 7,9, 66 мИ ацетата калия, 10 мИ ацетата магния, 0,5 мМ дитиотрейтола, 0,1 мг/мп апьбумчна сыворотки крупного рогато- lð

ro скота, по 1 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Образовавшуюся ДНК с тупыми концами экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают при 0 С в течение

15 мин 0,45 M ацетата натрия и

0,6 об.ч 2-пропанола, С полученной

ДНК лигируют смесь олигонуклеотидов.

12-мера 5 -AGCTTAAAGATG, 8»мера

5 -CATCTCCA, которая дает Hind IIIместо разреза и трансляционный старт» 20 кодон ATG. По 1 нмоль этих двух олигонуклеотидов лигируют с ДНК-фрагментом в 20 мкл с помощью 14 ед. лигазы в течение 40 ч при 4 С, После инактивации фермента при 70 С полученную ДНК в 100 мкл разрезают с помощью 80 ед» Hind III и 20 ед. BglII и ДНК-фрагменты длиной примерно

190. к,Ь. выделяют из 2 ного агарового геля на Е81 бумагу и очищают, 30

Полученный ДНК фрагмент лигируют с

50 нг разрезанным Hind III-u BglII рАН51»вектором и транслируют E.coli

НВ 101„Из 65 полученных колоний выделяют 4 плазмиды, которые обладают желательным рестрикционным рисунком.

Из них выделяют один Hind III—

BamHI-ДНК-фрагмент, который подвер гают анализу последовательностей по методу Сангера Эту плазмиду обозна- 40 чают как pAH51/2 ° 20 мгк плазмиды

pAH51/2 разрезают рестриктазами

SphI u Hind III, образовавшийся ДНК» фрагмент длиной 1,0:к.Ь . выделяют из агарового геля и лигируют с 40 нг 45 разрезанной с помощью Hind III- u

SphI-плазмиды parpATER103 ° ! дополнительно имеет сингулярное

BamHI-место разреза, В плазмиде рАН53 триптофановые про моторы, ген 0 интерферона, устойчивый к ампициллину ген и начало репликации ориентированы в одном направ ленни, Плазмиду рАН53 получают из плаз мид рАН52 и pBR322 следующим образом, 10 мкг рАН52 разрезают с помощью

SphI и EcoRI, ферменты ннактивируют при 70 С и после добавления по

0,15 мМ dATP, dGTP, dCTP u dTTP ДНК концы делают тупыми с помощью фраг» мента Кленова в течение 1 ч при

22 С, ДНК-фрагменты фракционируют по величине в агарсвом геле и выделяют фрагмент длиной 1, 1 к,b» который содержит промотор и ген интерферона

l0 мкг плазмицы pBR322 переваривают с помощью EcoRI и Pvul; концы также выпрямляют с помощью фрагмента Клено» ва и затем дефосфорилируют с помо 1ью фосфатазы, телячьего кишечника, ДНК-фрагмент длиной 2,4 к,Ь. выделяют из агарового геля. Оба полученных таким образом фрагмента ДНК лигируют с помощью Т4-ДНК-лигазы и трансфор мнруют Е.coli HB 1О1.» Таким образом получают экспрессионную плазмиду рАН53, которая содержит два места распознавания EcoRI.

Пример 2 Получение экслрес сионной плазмиды рАН62 дпя получения лошадиного Я -интерферона„

Стадии А-В осуществляют аналогич» но примеру l

Стадия. Г Скрининг лошадиной ген библиотеки генов интерферона, По О мкг высокомолекулярной ло» шадиной ДНК полностью переваривают с помощью EcoRI (Hind III), разде ляют путем электрофореза в 0,8%ном агаровом геле и переносят на нитроцеллюлозные фильтры, Готовят радиоактивно маркированную ДНК-пробу из Ps tI - BglII-фрагмента, коди» рующего человеческий /3 -интерферон кДНКклона PIP!2. Эта проба кодирует аминокислоты 48-166 зрелого

Р-интерферона, Нитроцеллнитозные фильтры предварительно гибридизируют в течение

7 ч при 65 С в 5NSSPE (0,9 M хлорис» того натрия, 50 мМ гидрогенофосфата натрия, 5 мИ ЭДТА, рН 7, 4), 5 k р аст вора Денхардта (О, l фиколла, О, 1%!

642956

АйБСТТЕAIICCТАбТТТТСйбТ7АТйТТб1й8АТАбТТБй6АIТбССйбАГАЛАбСйАСййАТбТббСТбАбАААБС7А7БТБАТБГСПБСТБТАСАТБ !01 бттббббссстйсййжчАтттйбйтятбсттйбттбййсйпйт!сбйтбстйбятй,".ААААААбтйббптбтсптпТААААТСАТААААТБСАТАТАпт47761777678Ат 7".е

Я67БТАЯПБ8бй4ТТАААТСТААТТСП4ТбАйАййбмйАТТСССА1АСАААбАССССТСАААйАСАТС7СА7ААТАСТААААСАААААААТЯААААПАСТТТОССАААТБАСАБА 771

АС7С76ТА4ТА8САбй6ТССТАААТбАПТА6СТТАТТТТ6Т7ССТТббТАТПйАСААТАСА6ТбЯСАСТТТЮчААСАТТАБАААТССТСАБАБТТТБТЯТБТПТССССТААГА! 756 АСАТА4А4ТАА4АТАб8йСТПААббЯТАСА6АбТПТА6АбйСТАСАААТААТбТМАТбАСАТАБ6ААйАСА6АААб8БйБААСТБАААБТБББАААТТССТСТБАААТйбйййбйб 577

768466АССАТСССБТАТАА, TA6CCCACACICAC88A88A4S6ACATtIААБСТСАА8ССбТТБССАССТССАСТГбаСТСС1Я6БбА6ТААА6БСйАСАСТБТТССТБТСПСАТС iyh

«БФ -l5 -!Ф е5 -! 5

tyr Ar6 Try lle Lee РГО ба! Я!а Lee Lee Lse Cys the Ser ВГ thr Я!а Lee ЙаГ Фа! Ase Tyr ИФ Еаа Lse Ary Зе Иа

416 NX TAC 466 Тбб ИС CTC CCA ЯТБ БСС CTC CTS CIS táf ПС TCC ACC 4СБ 6СТ CTT ICT БТБ AAC TAI SAC TTS CTI Сбб ТСС САА 78Ь!

Ф l5 20 25 76 И

Lee erS Ser Ssr Ase М ИЯЯ аа Set u Lee ArS Sle Lee Aaa Sly А! а pre 6!а Агб НРеа Ne Ase fhr Set яsа the 6!а

СТФ 664 NiC ASC ААТ ICA SCA láf С16 Иб СТС СТФ СБФ CAS ПФ 441 664 SCC ССТ CAA CSf ISC CCC 646 SAC ACA 416 ААС ПС CNi 67Ь

l0 s5 5Ф 55 ЬФ 65

7а! tre Иа 67 ° Ile Sle 67а Иа Sle Sle the БТа Lys 6!а Asy Иа Иа Lee Ы tle Туг Sle Ба! Ма 67а Itis Thr Iry Агб Па

tC CCf 646 @Vs 4П 6А6 САА БСА САБ CNi ПС САФ 446 6АФ БАТ SCf SCA ПФ ФТС ЯТС ТЯТ 646 4f6 СТС САФ CAC ACC T66 СФТ ЯП !ЬЬ поливинилпирролидона, 0,1Х альбумина сыворотки крупного рогатого сКо .та, 0,1Х альбумина сыворотки круп» . ного рогатого скота), 0,1Х ДСН, 20 мг/мп ДНК иэ спермы лосося, затем гибридизируют в таком Tse растворе, но без ДНК из спермы лосося с использованием 13110 срш маркированной пробы, После инкубации при 65 С в течение ночи, фильтры промывают четырехкратно в течение 1-1,5 ч в

3 x SSC (0,45 М хлористого натрия, 45 мМ цитрата натрия), О, !% ДСН при

65 С и экспонируют в течение 7 дней на рентгеновской пленке фирмы "Кодак" с помощью усиливающих пленок фирмы

"Кодак"

Дн скрининга генов интерферона в библиотеке лошадиных ДНК применя» ются такие же условия гибридизации.

600000 рекомбинантных лямбдафагов наносят на содержащие штамм

Е.coli HN 528 плотностью 30000 пятнообразующих единиц на 13,5 см пласти» ны. Четырехкратные нитроцеллюлозные репликаты готовят с каждой пластины

После высушивания в течение 2 ч при 80ФС фильтры промывают в течение ! 5 ч при 65 С в 1 М хлористого нат рия, l0 MM трис-НС1, рН 8,0, 0,1Х

ДСН, предварительно гибридизируют в течение ночи и по 2 реплики каждой пластины гибридизируют в течение

24 ч с использованием а!О cpm пробы радиоактивного -интерферона на фильтр, 11осле трехкрат7!о повторен ного скрининга получают 6 клонов лошадиного !ф-интерферона, которые дают положительные сигналы гибридизации, Стадия Д, Характеристика рекомбинантных фагов, Из 3 гибридизирующихся с человеческим 3-интерфероном рекомбинантных ДНК готовят фаго вую ДИК ДНК, переваривают с помощью EcoRI „

BamHI, Hind III, PstI, BglII, SalI, SmaI и путем злектрофореза разделяют в 0,8%-ном агаровом геле, Величина гибридизирующихся фрагментов опреде-!

5 ляется по способу Саусерна, Положение рестрикционных мест внутри лямбдавставки определяют после частичного рестрикционного переваривания лямбдыДНК, маркировки правых или левых ту20 пых концов лямбда-ветвей синтетическими, маркированными P-32 олигонуклеотидами и электрофореза в 0,45%.ном агаровом геле

Стадия Е„ Субклонирование гена лошадиного /3 -интерферона, PvuIII-фрагмент длиной 4,5..к,Ь., который гибридизуется: с пробой человеческого/3 -интерферона выделяют, очищают, лигируют по SmaI сайту плазмиды pUC9 и трансформируют Е.coli

IN 101» Трансформант с желательной вставкой (pAH60) выращивают и плазмиду характеризуют, Последовательность Hind III-фраг

35 мента, аминокислотная и нуклеотидная по следовательно сти Eg-/ -интерферо на, рАН60 представлены ниже

l7!

1642956

М 15 65 ЧБ f5 Ъе АУЧ Arq Иа Рти Al ° Ser Ттм 61У ТгР Азл Sla Thr !le Ч41 (Ta A@a Сю Lee Чд! Sla Ча1 Б!4 Lea Ola het ИР МЕ Lea Sla TC AS4 AS4 44T TTC БСТ ASC ACT ББС Т66 ААТ БАБ АСС АТС БП 446 AAC СТС СП 6ТБ 6А4 БТС САТ 06 СА6 416 6AC CST СТБ 648 1454

:BS !45 !!Б l l5 12Ф . Ж

> 4*4 Lea БТ ° 611 Ие het 6la БТа Sla Ser Ser Tbr Trp 61 у Я|ТЪг Thr Ив Lea ArB Lea lla (ур Tyr Tyr 61 у Агф ИР Ser (4 МС СТ6 БАБ 6 4 ATA AT6 646 SAS QA ASC ТСС ACC ТББ 664 AAC АСА АСС ATT CTS (БС СТ6 446 AAA TAC TAC 66А АББ АTC TCS !144! о 15 I40 !45 154 !Я «Tr " LTa Ale LTa LTa Tyr Ser Б!зiСуЯ411 Trp Ттй Чй ЧА! 614 Ale Sla het Lee ArB Asn (1а Ale the Lea 444 Б!у Leu

:Б ТАС CTS ААБ KC AAS 446 ТАС AS: САС 161 БСС 166 A(4 STS БТС СР4 БСБ 644 ATS СТС А66 ААС ПЗ БСС ПС СТТ ААС ББА СТС !254 ь 145 т АЯР Тр (и Б!е Ааа -4 БАТ ТАС СТС САА ААС 164 ББАТСТСССАБССТБСА((1(656:АБББАСААТБ(ТБАСАБТБАСТБ(ЛЕБТБТСПСССАБСАБА55(ТСПБА(БТБАСТБАСАБСТ !548

"БЕ(А(ТЕ(АТ166АААЕБАСАБТТАСАБАСТТТАСАТ Т П TTACTAACTTA 1ÁÀÀÏÀÀ(ПАТТ Т ПСТАТТТАТТТ(ААСАТ ПАССТТББАААА1 ААА1ПТПАТБАААСААА НЬУ ттсААсАсБестБтптААтттсААстт6Аттт41АеААтсА((сАеттАААААст6(АААс(А(с1БтААтБтт(птетААААтБ16(сте(ААА(146тАтАБттт(т66сс .34

:ткстт(ААБеААтпАААА1ссАА55АА6сс4т6сББААтАтАсыБАтААеА65теАББ5БеАсст(АА(с5тАсАББАБААем416165(!!БАБ((с(414!Ам(ББАА 114: ААААт6ееАеА6АсАе6(А5А5Бс1стБ5АстсАБА5еАсе66Б(тБ(тБсттстБ((стБтБт((сБ(т(т(тББ((((А(АБттА5ААт(тОАте5(тст(466616с((46466 !31!.:1А16тсАестстте(51115(стеБАБ(1(АТ((с!А(!А!с(6(еАБА15(т(тесст(с((сА(ссст(ААсс(сА(АееАтт61 тАтттстБтессстЕ(ААесст445 !145 ъ:5АА51(с(АББ(А(тт(1666А(А(161446166(АБТ(((птАТББ А(тстт(ттеБАА(г»((БАБ(1614(Аее!БтстААББББАБ((АБ(БтстстБТ(т(стт((А 1 0д кА(АБА(А(ААБ55ААБАААБАА(т(ТБттт(АтА сс(16((Ат(65(стебттттБ(тсс(1411111((АБАБАА5(АА61(16(тс,".Бкптт((15(16(!(те(61(т 2!BI

АБС(САСАСТСТССССАААБ"„(АБЕБ((ААБЕСАЕБТЕ Б(АЕАТТАЕБТ((АБТ(Т(АББ((АБТ(АБААА(СЕББАГ(АТБЗЕАЕАСААББАААТТ(АББ!ЕББАТАБАБАББ 1104..А(тААетт(((А655(ттА(А(т - 5ААА1ТББАеАттт((тАБЕАБ(тстттБББ(А((5 ((АБ(АТАе(т5(тттт(15!с!515(ТБАА(((ттееБАА(575(лтт41141 11!у :!511(11(с(АТ:Ае(АББББАт((Бт(54((те;АБ((АА „тт

:АЛЬТ

Остающиеся однонитевые участки

ДНК переваривают с 150 ед» SI-нук» леазьт в 400 мкл реакционной смеси в о течение 2 ч при !4 С (14 мМ ацетата цинка, 30 MM ацетата натрия, 250 мМ

Стадия Ж„Конструкция экспрессионной плазмиды рАН62 для зрелого лошадиного Р -интерферона.

30 мкг плазмиды рАН60 разрезают с помощью 30 ед HgiAI в 150 мкл объе ма, После инактивации фермента при

70 С 3 -выступающие ДНК-концы затупО ляют в течение 30 мин при 37 С с по» 40 мощью 7 ед, Т4-ДНК плазмиды (в при сутствии по I мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP). На тупые концы лигируют БрЬТсвязки, получен» ую ДНК разрезают с помощью .SphI u Hind III. Образовав- 45 шийся ДНК фрагмент длиной 1, 85 кЬ. выделяют из агарового геля и лигируют с 50 нг разрезанной Hind III u SphI плазмиды parpATER103Ä Полученный пос ле трансформации Е.coli НВ 10! клон содержит плазмиду рАН6! ° Эта, плазмида

50 представляет собой промежуточную сту» пень дпя дальнейшего построения экспрессионной плазмиды, 20 мкг плаз» миды рАН61 разрезают BamHI u Sall u образовавшийся фрагмент ДНК длиной

1,3 к,Ъ, выделяют из агарового геля, очищают и лигируют с переваренной рестриктазами ВапН1 и Sall !!1Зтр9- фаговой ДНК, После трансформации

Е . coli IM 101 из рекомбинантного М! 3» фага (M13pAH61) выделяют однонитевую фаговую ДНК. 3 пмоль этой одноиитевой

ДНК смешивают с 38 пмоль 15-мерного олигонуклеотида 51 СТСААСТАТСАСТТС в

50 мкл 20 мМ трис.-НС1, рН 8,0 и

10 мМ хлористого магния, нагревают до 95 С и медленно охлаждают до ком» натной температуры, Олигонуклеотид точно связывают начиная с первого основания последовательности зрелого финтерферона„Синтез двунитевой

ДНК исходя из 15-мерной затравки осу» ществляют в !00 мкл объема после до бавления по 3 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 15 ед, фрагмента Кленова в течение часа при 22 С, После до» бавления 20 мМ ЭДТА ДНК экстрагируют фенолом и хлороформом и осаждают этанолом

56

l 9 . 16429 хлористого натрия, 5Å глицерина, рН 4,6). Реакцию прекращают путем доб авления. ЭДТА, экстрагируют фенолом и хлороформом и ДНК осаждают этанолом Полученную ДНК с тупыми концами лигируют со смесью олигонуклеотидов 12-мера 5 -АССУТАААСАТС

I и 8-мера 5 -САТСТТТА, образовавшую" ся ДНК разрезают Hind III u SphI.

ДНК-фрагмент длиной 1,1 к Ь. выделяют из агарового геля и лигируют с плазмидой parpATER103, разрезанной по Hind III- u SphI-сайтам, После трансформации Е,cali НВ 101 получают

54 колонии, Из 9 изолированных из них плазмидных ДНК выделяют фрагмент

EcoRI — SalI длиной 1,3 к,Ь,, кото» рый подвергают анализу последовательностей по .методу Сангера, Полученную из него плазмиду обозначают как рАН62 ° Она позволяет осуществлять эффективную экспрессию зрелого нонадиного интерферона н E.со11.

Пример: 3» Экспрессия ин- 25 терфероно вой акти вно сти штаммом

Е.coli НВ 101, содержащей экспрес сионную плазмиду рАН52, pAH52/2, рАН53 или. рАН62»

100 мп бактериальной культуры ин 30 кубируют при 37 С при интенсивном встряхивании вплоть до указанной в таблиц е о птиче ской плот но сти при

600 нм в следующей, не .содержащей триптофана, среде (на 1 л среди):

10 г фосфата аммония, 3 5 r гидрогенфосфата калия, рН 7,3, 0,5 г хлористого натрия, 21 г -CaS-амина кислот (ки слотно гидрализ ованных), 11 г глюкозы, 1 мМ сульфата магния, 0,1 MM хлористого калия, 1 мг тиани на-НС1, 20 мг L-цистеина, 20 мг

3- 3индолакриловой кислоты (индукто ра триптофанового оперона), Кроме того, среда может еще содержить 50

100 мг ампициллина, Затем бактерии центрифугируют в течение 5 мин при

4000 об/мин, суспендируют в охлажденной льдом среде 50 мМ трис-НС1, рН

8 0 и 30 мМ хлористого натрия, взятой

50 в количестве 1/10 объема культуры,и при охлаждении во льду в течение

30 с дважды обрабатывают с помощью ультразвука (20 кГц, 100 В). Остатки разрушенных клеток удаляют в течение

10 мин при 10000 об/мин (4 С) и пос ле стерильной фильтрации надосадач ную жидкость исследуют на интерфероновую (ИФ) активность в общеприня том oIlhlTe для определения цитопати» ческого эффекта везикулярного вируса стоматита (ВВС) или вируса энцефаломиокардита (ВЭЦК) .

Результаты представлены в таблице»

Титр на À549-клетки нормирован в межпународных единицах с использованием человеческого интерферона.

Фо рмул а и з об р ет ения

: 1. Способ получения лошадиного онн Р-интерферона, заключающийся в том, что ткань печени лошади инкубируют в присутствии буфера, рН 8,0, экстрагируют ДНК с использованием фенола, диапизуют и осаждают ДНК этанолом, полученную ДНК центрифугируют при

40000 об/мин в буфере, рН 8,0, далее диализуют и осаждают этанолом ДНК длиной более 50: к.Ь., которую подвергают частичному перевариванию эндонуклеазой Sau3A в присутствии бу" фера, рН 7,5, полученные фр агменты фракционируют электрофорезом, з атем выделяют фрагменты длиной 10-23 к Ь., дефосфорилируют и клонируют в векто ре EMBL3(-ÇA), полученную ген биб» лиотеку ДНК подвергают скринингу с помощью радиоактивно маркированных интерфероновых генов человека с выделением гомологичных последователь ностей, при этом для получения -интерферона Hind III-фрагмент клона

Eg-gl лигируют с гидролизованным с помощью SmaI и дефосфорилированным вектором pUC9 подученными рекомбинантными ДНК трансформируют бактерии

Escherichia coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампицилпину клоны, со держащие плазмиду рАН50, далее плаз миду рАН50 обрабатывают Hind IIIэндонуклеазой и лигируют с обработанными полинуклеотидкинаэой ЯрЬ?-связками, получают плазмиду рАН51, плазмиду рАН50 гидролизуют PvuII, лигируют с оли гонуклеотидом

5 - TGTGACCTGCCTCAC, который предвари тельно обрабатывают полинуклеотидкинаэой, денатурируют ДНК кипячением, удлиняют олигонуклеотидную затрав» ку с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP, удаляют З -выступ ннкубацией с

Т4 ДНК-полимеразой в присутствии

dATP, dGTP, dCTP и dTTP, далее фрагмент лигируют с олигонуклеотидами, 1642956

12-мерам 5 -AGCTTAAAGATG и 8 мерам

5 -САТСТТТА, полученную ДНК обраба» тывают эндануклеазами Hind III u

BglII, и фрагмент длиной 190 к Ъ. лигируют с гидролизованным Hind III и BglII вектором рАН51, полученную плазмиду рАН51/2 обрабатывают SphI и Hind III и лигируют с Hind III—

SphI или Hind III — Ваш11Е фрагментом плазмиды parpATER 103 с получением экспрессионной плаэмиды рАН52 или рАН52/2, или плазмиду рАН52 гидролизуют эндонуклеазами SphI и EcoRI, затупляют концы ДНК с помощью фрагмента

Кленова в присутствии dATP, dGTP, dCTP и dTTP, получают ДНК длиной

1, 1 к Ъ,, затем плазмиду pBR 322 переваривают с помощью Pvull и EcoRI, затупляют концы ДНК с помощью фраг- 20 мента Кленова и дефосфорилируют с получением ДНК длиной 2,4 к Ь., которую лигируют с ДНК длиной 1,1 к Ь. с получением экспрессионной плазмиды рАН53 для получения OC-2-интер» ферона плазмиду pRH.63, получаемую путем субклонирования рестрикционного фрагмента EcoRI длиной 3,3 к.Ъ. из лямбда клона Eg-@ 6 в EcoRI сайт плазмиды pUC8, обрабатывают BgIII и 30

BamIII и получаемый при этом фрагмент ДНК длиной 1,0 к,Ь., содержащий кодирующую последовательность для 2-интерферона 64»й аминокислоты, лигируют с большим фрагментом, содер- 3 жащим плазмидный вектор, промотор и кодирующую последовательность для первых 63 аминокислот зрелого интерферона, который получают в результате обработки BgIII- u BamHI-плазмиды

pAH52/2, дефо сфорилируют с помощью фосфатазы телячьего кишечника, продуктом лигирования трансформируют бактерии Escheri "hia coli hB 101 с получением э кспрессионной плазмиды 45 рАН55, а для получения (3-интерферона

PvuII-фрагмент отобранного клона

Eg-Рб лигируют с гидрализованным с помощью SmaI и дефасфорипированным вектором pUC9,. полученными рекомби» нантными ДНК трансформируют бактерии

Е.coli IM 101 и отбирают устойчивые к ампициллину клоны, содержащие плазмиду рАН60, затем плазмиду рАН60 обрабатывают HgiAI-эндонуклеазой и после выпрямпения 3 выступающих концов ДНК с помощью Т4-ДНК полимера зы тупые концы лигируют с обработан» ными полинуклеотидкиназой SphI-связ ками, ДНК гидролизуют SphI u Hind III, полученный фрагмент длиной 1,85 к.b. лигируют с разрезанной Нind III u

SphI плазмидай parpATER 103, полученную плазмиду рАН61 обрабатывают

BamHI u SalI с получением фрагмента длиной 1,3:к,Ь., который лигируют с переваренной BamHI u SalI NI3mp9-фа гавай ДНК, полученную однонитевую

ДНК лигируют с олигонуклеотидом

5 -GTGAACTATGACTTG, который предва

1 рительно обрабатывают полинуклеотидкиназой, затем денатурируют ДНК кипячением, удлиняют олигонуклеотидную затравку с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP аСТР, dCTP u

dTTP и осаждают, оставшиеся однонитевые участки ДНК переваривают с по мощью SI-нуклеазы и ДНК с тупыми концами лигируют с олигонуклеотидами, 12-мерам 5 -АССТТАААСА6 и 8-мерам

5 САТСТТТА, полученную ДНК обрабаты вают эндануклеазами Н пс! ЕЕЕ и $рЬЕ, фрагмент длиной 1,! к Ъ лигируют с

Hind II — SphI фрагментом parpATER103 с получением экспрессионной плазмиды рАН62, экспрессионными плазмидами трансформируют штамм бактерии E.coli ЕИ 101, культивируют штаммьг-продуценты в жидкой питательной среде, вы» деляют и осаждают белок из культуральнай жидкости с -паследукщей очисткой хроматографией„

2 ° Способ поп 1, отличаю шийся тем, при получении0(-ин терферана осаждение белка осуществ» ляют путем добавления сульфата аммо» ния да 657-ro насыщения,, центрифугирования и диализа, а очистку проводят двустадийной колоночной хроматогра фией с использованием на второй стадии моноклонального лошадиного интер» феронового иммуноглобулина с последую щей элюцией связанного с антителам интерферона раствором, содержащим лимонную кислоту, доведением рН до

4,5 и хроматографией полученного су нернатанта на катионите и элюцией раствором ацетата аммония, 3 ° Способ по.п 2, о т л и ч а юшийся тем, что при получении

3 -интерферона выделение белка право дят путем добавления сахарозного бу фера, содержащего лизоцим, центрифу» гиравания, добавления к супернатанту полиэтиленимина и повторного центри» фугирования, а осаждение проводят добавлением к надосадочной жидкости сульфата аммония 50Х, трехкратным центрифугированием суспендированием полученного осадка в буферном рас1» воре с добавлением полиэтиленгликоля после первого центрифугирования и в

Тест система: NSL- 6-клетки (ATCC СС1 57, клетки эпидермиса кожи лошади)/ВВС; клетки А549 (АТСС CCL 185, клеточная линия рака легких человека)/ВЭЦК, Е.coli H5 101, Оптическая ИФ актйвность, ед/л культуры со держа щ и плотность плаз миду при 600 нм NBL-6/ВВС А549/ИЭЦК

1,8х10

2 0„106

1,, Зх10

1,! х10

5,2х10

7, бх10

6, 2х10 ."-!О

5 2xl0.- 2,6х10

Редактор ЛПчолинская

Заказ 1153 Тираж 386 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 рАН52 4,2 рАН52/2 6,06,0 оАН53, 5,75,7 рАН62 3,03,0

HS12 (с2С-ин терферон, стандарт ) ! 642956 сахарозном буфере после второго, с

noследукщей очисткой центрифугирЧв" вием, аффинной хроматографией с использованием сахарозного буфера и хроматографией с обратной фазой, Составитель:Т Забойкина

Техред M.Дидык Корректор:ll,Ïèëèïåíêî