Способ анализа жидкой среды на присутствие мелатонина

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

3 В

РЕСПУБЛИК

ОЕ (11) (51)5 С 01 И 33/18

Д

$ с

1-

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н AS V

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ГЮ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4626084/13 (22) 28. 12.88 (46) 30.04.91. Бюл. И- 16 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) О. В. Бурлакова, В..А. Голиченков, Е.Н.Калистратова и Д.В.Попов (53) 591.481:591.176:597.8(088.8) (56) Mori W., Lerner А.В. A,microscopic bioassay for melanonin. Endocrinology, V. 67, 1960, М 4, р.443-450.

Bagnaro J.T., Taylor J.D. u

Hadley М.Е. The dermal chromatophore

uhit. — J.Cell.Вiol, V. 38, 1968, р.67-79.

Ralph Ch.L., Lynch Н.J. А.quanti.tave melatonin Ьioassay. — Gen.and

Comp Endocrinology, V.15, 1970, р.334-338.

Higben L., Slome D, The pigmentary effector system. VI. The duel

character of endocrine coordination in amphibian colour change.-Proc.

Roy.Soc., London В., 1931, V.108, р. 10-53.

Изобретение относится к способам биологического определения гормонов и биологически активных соединений в испытуемых образцах и может быть применено в практике биологических исследований, биотехнологии, эндокринологии, фармакологии, в частности— мелатонин может быть исследован в практике зоотехнических работ, ветеринарии и медицине, как регулятор биологических ритмов животыых и чело2 (54) СПОСОБ АНАЛИЗА ЖИДКОЙ СРЕДЫ НА

ПРИСУТСТВИЕ МЕЛАТОНИНА (57) Изобретение относится к способам биологического определения гормонов и биологически активных соединений и может быть использовано в биотехнологии, эндокринолоГии, фармакологии. Целью изобретения является повьппение точности и упрощение анализа, а также расширение функциональных возможностей способа. Изолированные участки кохи предварительно адаптированных к темному фону личинок бесхвостых амфибий выдерживают в культуральной среде с испытуемым образцом общим обьемом 1-2 мл на свету в течение не менее 30 мин. После чего регистрируют характер распределения пигмента в меланофорах,используя меланофорный индекс, в зависимости от которого определяют наличие или отсутствие мелатонина в испытуемом образце. 1 табл. века (уровень гормона мелатонина в организме определяет суточные и сезонные колебания функциональной активности позвоночных животных и человека," йрименение этого гормона позволяет корригировать нарушение физиологиче- еЬ ских ритмических процессов в организме).

Цель изобретения " повьппение точности и упрощение анализа, а также

1645892 расширение функциональных возможностей способа.

Использование в качестве тест-объекта изолированных участков кожи личинок бесхвостых амфибий позволяет увеличить точность анализа за счет повышения специфичности реакции пигментных клеток, так как исключаются влияния собственной эндокринной 10 системы целого животного. К тому же, использование изолированных участков кожи позволяет в 10 раз снизить объем тестируемых образцов.

Способ значительно повышает точ- 15 ность определения, благодаря исключению реакций пигментных клеток других типов, присутствующих в коже взрослых животных и влияющих на суммарную светочроницаемость кожи.

Использование кожи личинок бесхвостых амфибий значительно упрощает способ, не требуя для регистрации ответа специального фотометрического оборудования и высокой квалификации исполнителя, что значительно удешевляет определение. При этом не ограничивается время проведения тестирования в течение суток за счет исключения влияния на реакцию пигментных клеток собственной суточной ритмики эндокринной системы организма, что упрощает способ и обеспечивает его применение в любых областях народного хозяйства для серийного определения, при этом уменьшается количество животных, необходимых для тестирования (3 кусочка изолированной кожи или 1,5 личинки на одно разведение и 10 личинок в прототипе), поскольку исключаются индивидуальные различия в реакции целых животных.

Это упрощает определение и сохраняет животных. Предлагаемый способ расширяет круг тес-объектов, поскольку возможно использование для тестирования личинок многих видов бесхвостых амфибий.

Способ реализуют следующим образом.

Пример 1. В качестве тестируеМогп образца берут раствор синтетического препарата мелатонина B концентрации 1 ° 10 г/л. Выполняют шесть последовательных 10-кратных разведений тестируемого образца в стандарт- 55 ном физиологическом растворе для холоднокровных животных (объем кажпого разведения 2 мл). Берут 9 личинок травяной лягушки, предварительно содержашихся 45 мин в сосуде с темным дном на свету для того, чтобы пигмент в меланофорах кожи максимально диспергировал (личинка благодаря этому выглядит черной). Лезвием безопасной бритвы вырезают симметричные сегменты головного участка под глазами (левая и правая "щс ки") каждого головастика, По три и золированных указанным образом кусочка помещают в каждое приготовленное разведение образца так, чтобы кусочки от одной личинки оказались в разных тестируемых пробах. Через 30 мин кусочки кожи помещают в фиксатор (47,-ный формалин), просматривают под лупой, отмечают количество пигментllblx клеток меланофорным индексом "1", "2", "3", "4", "5" и выводят средний меланофорный индекс (M1) для 100 просчитанных клеток трех кусочков кожи, инкубируемых в одном разведении. В результате средний М1 пигментных клеток кусочков кожи, инкубированных l3 первом разведении (1 10 г/л) испы.туемого препарата, низок (средний М1 = 1,5), в кусочках из второго разведения степень дисперсии минимальна (М1 = 1) . В кусочках кожи из третьего и четвертого разведений M1 = 1,8 и М1 = 1,3 соответственно, в пятом и шестом разведении пигмент в меланофорах инкубированных кусочков кожи диспергирован (М1 = 4,3 и М1 =4,1 соответственно), т.е. отсутствует реакция на мелатонин (считают, что реакция агрегации пигмента отсутствует, если M1>"3").

Следовательно, в четвертом разведении (наименьшем, где обнаружена реакция меланофоров на мелатонин) концентра- ция мелатонина определяется равной

1 10 г/л, т.е. в исходном образце

-7 концентрация мелатонина составляет

10 г/л, Пример 2. Берут 1 мл сыворотки крови взрослой травяной лягушки, выполняют четыре последовательных 10-кратных разведений тестируемого образца сыворотки на стандартном физиологическом растворе для холоднокровных (объем каждого разведения 1 мл). Берут 6 личинок шпорценой лягушки из сосуда, стоявшего на темном фоне на свету 6 мин (для полной дисперсии пигмента в меланофорах кожи личинки — личинки темные). Лезвием безопасной бритвы вырезают сим1645 метричные сегменты г< ловногп участка личинок под глазами и помещаю-. п олированные ",ëêèì обра..)nrem кусочки по

3 шт. в каждое разведение тестируемого образца так, чтобы кусочки от

5 одной личинки оказались в разных тестируемых пробах. Через 45 мин кусочки помещают в фиксатор, просматривают кусочки под лупой и определяют средний М1 меланофоров кожи изолятов, взятых из каждого разведения. Получили, что средняя степень дисперсии пигмента в меланофорах в первом разведении испытуемого образца М1 = 2,1, во втором М1 = 4,3, в третьем 4,6, в четвертом М1 = 4,0, Таким образом, во втором, третьем и четвертом разведекиях образца отсутствует реакция меланофоров на мелатонин. В первом раз- 20 ведении концентрация мелатонина со-7 ответствует 1 ° 10 г/л. Следовательно, в исходном образце концентрация мелатонина в 10 раз больше, т.е.. 1 10 г!л.

В таблице приведены результаты сте-25 пени дисперсии пигмента в дермальных меланофорах изолированных участков кожи личинок амфибии по окончании операции по тестированию синтетического мелатонина (указаны значения М1, сред- 30 нне для 100 клеток трех изолированных кусочков кожи, инкубированных в растворах, реакция на мелатонин отсутствует при М1р 3,00).

Как видно из таблицы, видовая при35 надлежность личинок, используемых в качестве тест-объекта, не влияет на результаты тестирования, Величина параметров делает определение невозможным. Более длительные сроки инкубации, 4р не влияя на результат, увеличивают время проведения опыта. Увеличение объема тестируемого раствора ведет к с;ижению чувствительности способа.

При недостаточном времени предва- 45 р:;тельной адаптации личинок на свету к темному фону не достигается максимальная степень дисперсии пигмента в меланофорах перед изоляцией кож:r для тестирования образца, поэтому мо- 5р жет не наблюдаться различия в М1, обусловленных присутствием мелатонина в растворе„ Увеличение времени предварительной адаптации личинок к темному фону на свету (более 45 мин) не влияет на результаты тестирования, однако удлиняет время проведения опыта, что нежелательно.

Использование способа определения мелатонина обеспечивает (возможность определения меньших количеств мелатонина в пробе, поскольку разведение образца в 10 раз меньшее, чем и известном способе, так как тестирование проводят на трех изолированных кусочках кожи вместо 10 личинок, как в известном способе, высокую точность способа, что обеспечивается стабильной реакцией пигментных клеток изолированных кусочков кожи, на которые не оказывают влияния,ни эндогенные организованные факторы, ни внешние неспецифические раздражители, упрощение способа за счет возможности проведения тестирования независимо от времени суток, так как меланофоры изолированных кусочков кожи не обладают свойственной целому организму изменению чувствительности к 3Kзогенным гормонам в течение суток. Кроме того, предложенный способ не требует специального оборудования и высокой квалификации исполнителя и значительно снижает необходимое для тестирования число животных, что в целом повышает экономичность способа. формула изобретения

Способ анализа жидкой среды на присутствие мелатонина, предусматривающий помещение бесхвостых амфибий в качестве тест-объекта в

3 культуральную среду, добавление в нее тестируемого образца, выдерживание в ней тест-объекта, регистрацию характера распределения пигмента в пигментных клетках (меланофорах) тест-объекта и определение присутствия мелатонина в тестируемом образце по степени посветления тестобъекта, отличающийся тем, что, с целью повьииения точности и упрощения анализа, а также расширения функциональных возможностей способа, в качестве тест-объекта используют изолированные участ" ки кожи предварительно адаптированных к темному фону в течение не менее 45 мин личинок оесхвостых амфибии, а выдерживание тест-объекта с тестируемым образцом проводят на свету в течение не менее 30 мин, при этом объем культуральной среды составляет от 1 до 2 м 1.

1 о450 2

Время инкубации в тестируемом растворе, мин

Объем тестируемого раствора, мл

Концентрация мелатони на, г/л

Биологический вид, используемый для

1,5 3,0

40 50

0 5 опыта

Время инкубации, меньшее указанного в формуле, недостаточно для агрегацни пигмента под действием мелатонина. ф%

Время инкубации в тестируемом растворе, превышающее укаэанное в формуле, не влияет на результаты тестирования, но удлиняет проведение тестирования, что немелательно.

Составитель О.Корменко

ТехРед М.Дидык Корректор A.Oáðó÷àð

Редактор М.Келемеш

Заказ 1347 Тирам 418 Подписное

ВЯКИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.умгород, ул. Гагарина, 101

Травяная лягушка (личинки)

Прудовая лягушка (личинки)

Шпорцевая лягушка (личинки) 10

107

Ь

Наблюдается не- 1 76 равномерное рас" э88 пределение пиг--" 46 э мента в мелано- - -3 форе, свидетель-2э13 ствующее о ги- 4 20 бели клеток иэ-1э75 за недостатка 1е95 раствора 4,52

1,53

1,47

3,38

1,87

2,15

4,17

1,62

1,80

3,97

3,80

3,70

4,20

4,72

3,90

3,97

4,14

3,62

3,54

1, 70 1,80

1,90 1,90

4, 10 3,85

2,35 2,17

2,13 1,90

4,30 4, 17

1,70 1,93

2,08 2,31

4,20 4,53