5-аминонафталин-1-сульфамиды в качестве детектируемых групп субстратов для флюоресцентного анализа пептидаз

 

Изобртение касается сульфамидов, в частности 5-аминонафталин-1-сульфамида,замещенного R₁ и R₂, где R₁-H, R₂ - C₁ - C₃ -алкил, изо - C₃ - C₄ - алкил, трет, бутил, амил, бензил, циклогексанил, C₂H₄OH, C₂H₄OCH₃, C₂H₄ - O - C₂H₅ или R₁=R₂=C_-2C_-5 - алкил или которые могут быть использованы в качестве детектируемых групп субстратов для флуоресцентного анализа пептидов. Цель - создание более эффективных веществ указанного класса. Синтез ведут реакцией соответствующего амина с 5-фталимидонафталинсульфохлоридом в среде ацетона с последующей обработкой гидразингидратом при кипячении в среде метанола. Выход, %, т. пл., ^oС, брутто ф-ла: 1) 84, 204 - 208, C₁₁H₁₂N₂SO₂; 2) 77, 130 -133, C₁₂H₁₄N₂SO₂; 3) 93, 115 - 118, c₁₃H₁₆N₂SO₂; 4) 91, 178 - 182, C₁*₃H₁₆N₂SO₂, 5) 85, 138 -139, C₁₄H₁₈N₂SO₂; 6) 92, 213 - 214, C₁₄H₁₈N₂SO₂; 7) 93, 233 - 234, C₁₆H₂₀N₂SO₂; 8) 80, 180 - 184, C₁₇H₁₆N₂SO₂; 9) 77, 140 -144, C₁₂H₁₄N₂SO₂; 10) 91, 111 - 115, C₁₃H₁₆N₂SO₃; 11) 93, 79 - 82, C₁₄H₁₈N₂SO₃; 12) 95, 104 - 107, C₁₄H₁₈N₂SO₂; 13) 80, 143 - 144, C₁₆H₂₂N₂SO₂; 14) 70, 106 - 110, C₁₆H₂₀N₂SO₂. Новые вещества позволяют увеличить относительную интенсивность флюоресценции и расширить ассортимент детектируемых групп субстратов. 4 табл.

Изобретение относится к химии аминонафталинсульфокислот, а именно к новым замещенным 5-аминонафталин-1-сульфамидам общей формулы I , где R₁ H; R₂ CH₃, C₂H₅, C₃H₇ изо-С₃Н₇, изо-С₄Н₉, трет-С₄Н₉, С₅Н₁₁, , H₂C, C₂H₄OH, С₂Н₄ОСН₃, С₂Н₄ОС₂Н₅ или R₁ R₂ C₂H₅, C₃H₇, или NR₁R₂ N(CH₂)₆, в качестве детектируемых групп субстратов для флюоресцентного анализа пептидаз. Целью изобретения является изыскание в ряду аминонафталинсульфокислот новых соединений, позволяющих при использовании их в качестве детектируемых групп увеличить относительную интенсивность флюоресценции и расширить ассортимент детектируемых групп субстратов. П р и м е р 1. 5-Фталимидонафталин-1-пентилсульфамид. 13 мл (0,11 моль) пентиламина и 14 мл триэтиламина растворяют в 500 мл ацетона, добавляют в течение 10 мин 37,1 г (0,1 моль) 5-фталимидонафталин-1-сульфонилхлорида и перемешивают при 20^оС 4 ч. Ацетон отгоняют при пониженном давлении, осадок заливают 1 л воды и через 20 ч отсасывают продукт. Промывают водой, сушат, перекристаллизовывают из метанола и получают 41,4 г (выход 98%) хроматографически и аналитически чистого продукта с т.пл. 155-157^оС, R_f= 0,71 (алуфол, диэтиловый эфир-бензол, 1:1). Найдено, C 65,54; H 5,26; N 6,67; S 7,39. C₂₃H₂₂N₂SO₄. Вычислено, C 65,39; H 5,25; N 6,63; S 7,59. Аналогично получают другие замещенные 5-фталимидонафталин-1-сульфамида. П р и м е р 2. Аминонафталин-1-пентилсульфамид. 4,23 г (0,01 моль) 5-фталимидонафталин-1-пентилсульфамида заливают 50 мл метанола, прикапывают 0,5 мл (0,01 моль) гидразингидрата и кипятят 4,5 ч. Метанол отгоняют, остаток экстрагируют 2х20 мл кипящего хлороформа, экстракт упаривают и остаток перекристаллизовывают из метанола. Получают 2,19 г (выход 75% ) хроматографически и аналитически чистого продукта с т.пл. 97-98^оС, R_f 0,53 (алуфол, хлороформ-этилацетат, 1:1). ПМР-спектр ( δ ДМСО) м.д. 0,66 (СH₃); 1,20 (СН₂); 2,75 (СН₂). Найдено, C 61,46; H 6,89; N 9,43; S 10,54. C₁₅H₂₀N₂SO₂. Вычислено, C 61,62; H 6,89; N 9,58; S 10,96. Аналогично получают другие замещенные 5-аминонафталин-1-сульфамиды. Их физико-химические характеристики приведены в табл. 1. Соединения формулы I представляют собой желтые кристаллические вещества. Для доказательства преимущества новых соединений определены их относительные интенсивности флюоресценции. Установление относительной интенсивности флюоресценции. Спектры снимают на спектрофлюориметре "Hitachi МРГ-4" (Япония) в относительном режиме при чувствительности 100. Относительную интенсивность флюоресценции рассчитывают по формуле J₅= ·A. где J высота полосы эмиссии, мм; с концентрация, моль/л; А соотношение максимальной чувствительности прибора и использованной чувствительности. Для 5-аминонафталин-1-пентилсульфамида (соединение 9 в табл. 2) получают J₅= 20,8. Измерение флюоресценции 5-аминонафталин-1-циклогексилсульфамида. 0,003675 г 5-аминонафталин-1-циклогексилсульфамида растворяют в 10 мл 95%-ного этилового спирта, 0,4 мл этого раствора разбавляют 10 мл фосфатного буфера с рН 7,2 (0,067 М) и снимают спектр. Концентрация измеряемого раствора 4,978^. 10^-5 моль/л, оптическая плотность при длине волны λ 350 нм 0,220; J 122 нм; I₅ 24,5. Спектры остальных соединений представлены в табл. 2, измерены по этой же методике. Сравнение проводят с известными замещенными аминонафталинсульфамидами 1 и 2 из табл. 2. Применение смеси 5-аминонафталин-1-сульфамидов в качестве детектируемых групп субстратов при определении ферментов. Методика 1. Синтез 5-аргиниламинонафталин-1-сульфамидов. К раствору 7 г карбобензоксиаргинина в 40 мл ДМФ приливают при -10^оС полученный при -30^оС и выдержанный при 20^оС в течение 40 мин раствор 2 мл SOCl₂ в 20 мл ДМФА, перемешивают 30 мин при 4^оС, охлаждают до -20^оС, добавляют раствор смеси 5-аминонафталин-1-сульфамидов в 20 мл ДМФА (15 соединений по 1 ммоль каждого; соединения и их количества указаны в табл. 3), вливают 3 мл триэтиламина, перемешивают 4 при 4^оС и 12 ч при 20^оС, добавляя триэтиламин до слабощелочной реакции; приливают 300 мл этилацетата и 400 мл гексана, осадок промывают смесью этилацетат-гексан, растворяют в смеси бутанол-вода, верхний слой отделяют, водный экстрагируют бутанолом. Бутанольные вытяжки промывают 5% -ным NaHCO₃, 10%-ным KHSO₄, упаривают досуха, заливают 80 мл 2,5М HBr в CH₃COOH, через 1,5 ч добавляют 1200 мл диэтилового эфира, осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Методика 2. Смесь солей аргиниламинонафталинсульфамидов, полученную по методике 1, растворяют в концентрации 7,0 о. е./мл ( λ= 300 нм) в 0,05 трис-HCl буфере (рН 7,4). К 2 мл раствора добавляют 10 мл трипсина (или другого фермента) в концентрации, обеспечивающей гидролиз 1% аргиниламинонафталинсульфамидов за 10 мин, перемешивают, инкубируют 10 мин; при 37^оС добавляют 0,6 мл смеси этилацетат-гексан (2:1), перемешивают, верхний слой отделяют, упаривают и разделяют ВЭЖХ на колонке СДС-С-18 при 40^оС элюацией 0,05М CH₃COONH₄ (35% ->> 58% линейный градиент за 20 мин) и ацетонитрила с задержкой градиента 6,5 мин. Детекция при 340 нм. Появление всех 15 аминонафталинсульфамидов в элюате с различными временами выхода показывает, что все они могут быть использованы в качестве детектируемых групп субстратов при определении как одного фермента, так и их смесей. Времена выхода приведены в табл. 4 по порядку их увеличения. Таким образом, соединения формулы I обладают более высокой относительной интенсивностью флюоресценции (14,6-25,8) по сравнению с аналогом (8,7-13,1). Они все могут быть использованы в качестве детектируемых групп субстратов при определении ферментов, так как обладают различными временами выхода.

Формула изобретения

5-Аминонафталин-1-сульфамиды общей формулы

где R₁ - H;
R₂ - CH₃, C₂H₅, C₃H₇, изо-C₃H₇, изо-C₄H₉, трет-C₄H₉, C₅H₁₁,

C₂H₄OH, C₂H₄OCH₃, C₂H₄OC₂H₅, или R₁ = R₂ = C₂H₅, C₃H₇, или NR₁R₂ = N (CH₂)₆,
в качестве детектируемых групп субстратов для флюоресцентного анализа пептидаз.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 8-2000

Извещение опубликовано: 20.03.2000        

---