Способ определения активности амилолитических ферментов

 

Изобретение относится к спиртовой , дрожжевой и микробиологической промышленности и направлено на ускорение определения оЈ-глкжозидаэы дрожжей и повышение точности ее опредедения. Определение активности с -глюкозидазы осуществляют в две стадии. На первой стадии в пробирку вводят исследуемый раствор дрожжей, концентрированную соляную кислоту, раствор сульфата цинка и железосинероднстого калия и раствор мальтозы. Содержимое фильтруют и определяют угол поворота плоскости поляризации. Параллельно на второй стадии в другую пробирку вносят раствор мальтозы и исследуемый раствор дрожжей. После инкубафш в термостате, реакцию гидролиза инактивируют соляной кислотой и осаждают белки и коллоиды добавлениьм сульфата игнка и железосинеродистого калия и определяют угол поворота плоскости поляризации. Активность глкжозидазы опредапяют по разности поворотов угла поляризации на первой и второй стадия;,. с SS (Л

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (1) С 12 N 9/34

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А8ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ стадия:.; .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

re ИЗОБРЕТЕНИЯМ V VWPm SM

flPH ГКНТ СССР (21) 4678095/13 (22) 13.04.89 (46) 07.06.91. Бюл. Р ;.1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии (72) В.С.Чередниченко, A.Ï.Ðóõëÿäåâà, И.М.Абрамова, E.Н.Пискарева и Т.Г.Воробьева (53) 663.1(088.8) (5e) Авторское свидетельство СССР

У 920069, кл. С 12 N 9/34, 1980. (54) СПОСОБ ОПРЦ(ЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

АМИЛОЛИТИЧЕС КИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к спиртовой, дрожжевой и микробиологической промьпппенности и направлено на ускорение определения g-глюкозидаэы дрожжей и повьппение точности ее определе" ния. Определение активности ь. -глюкоИзобретение относится к спиртовой, дрожжевой и микробиологической промьпапенности, а именно к способам определения активности ферментных препаратов.

Целью изобретения является ускорение определения М-глюкоэидазы дрожжей и повьппение точности определения.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят первую стадию анализа.

В пробирку вносят 15 см исследуемого раствора дрожжей, приливают последовательно по 1 см раствора соля-, ной кислоты концентрацией 5, О моль/дм, „, SU„1654336

2 зидазы осуществляют в две сталин. На первой стадии в пробирку вводят исследуеьп..й раствор дрожжей, концентрированную соляную кислоту, раствор сульфата цинка и железосинеродистого калия и раствор мальтозы. Содержимое фильтруют и определяют угол поворота плоскости поляризации. Параллельно на второй стадии в другую пробирку вносят раствор мальтозы и исследуемый раствор дрожжей. После инкубации в термостате реакцию гидролиэа инактивируют соляной кислотой и осаждают белки и коллоиды добавлени м сульд>ата ,инка и железосийеродистого калия и определяют угол поворота плоскости поляризации. Активность глюкозидазы определяют по разности поворотов угла поляризации на первой и второй раствора сульфата цинка с массовой »Р долей 15% и железистосинеродистого Э калия с массовой долей 30%. Осуществ- QP ляют осаждение белков и коллоидов.

Затем в пробирку вносят 15 см раствора мальтозы с массовой долей 10%.

Перемешивают содержимое пробирки и фильтруют. Определяют. угол поворота плоскости поляризации на автоматичес- 3 » ком поляриметре, автоматическом сахариметре или сахариметре с нормальной сахарной шкалой.

По углу поворота плоскости поляризации определяют концентрацию мальтозы, 1654336

Параллельно осуществляют вторую стадию. В другую пробирку вносят

15 см раствора мальтозы с массовой долей 1О помещают пробирку в ультратермостат с температурой 40+0,1 С и выдерживают при этой температуре

5-10 мин. Затем приливают 25 см исследуемого раствора дрожжей, быстро перемешивают и инкубируют субстрат с ферментом в течение 60 мин в ультратермостате с температурой 4,НО, 1 С.

Дрожжи при этом выполняют двойную функцию — гидролиэуют мальтозу до глюкозы и сбраживают образовавшуюся глюкозу до остаточного содержания мальтозы.

Через 60 мин действия фермента на субстрат реакцию инактивируют введением 1 см раствора соляной кислоты кон- п центрацией 5,0 моль/дм . После инактивирования фермента осаждают белки и коллоиды добавлением по 1 см сульфата цинка и железистосинеродистого ка тия. Содержимое пробирок перемеши- 25 вают, охлаждают до 20 С и фильтруют.

Определяют угол поворота плоскости поляризации.

Изменение величины угла поворота плоскости поляризации на стадии опре- 30 деления начальной концентрации мальтоэы и после ферментативного гидролиэа - оставшейся концентрации мальтоэы пропорционально количеству OG-глюкозидаэы и времени ее действия на мальтозу.

Расчет производят по формуле

О 0439 ДП 10 33 70 6 ЬП

МС --+-- — ---,— — — ---- ---- ед/г, Я 60 342 а а 40 где МС „- мальтаэная (М;глюкозидазная) активность, определенная поляриметрическим методом на мальтоэе и выраженная в 45 единицах на 1 r дрожжей;

0,0439 — коэффициент, определяющий количество мальтозы, прогидролиэованной для глюкозы и сброженной дрожжами, равное 50 разности между начальной концентрацией мальтозы и после hepMeHTaTHBHopo гидролиэа, г;

ДП вЂ” изменение угла поворота

„55 плоскости поляризации, рав" ное разности поляризаций контрольного и опытного растворов, град;

10 — коэффициент перевода граммов в микрограммы, 33 — объем раствора, который подвергается поляриметрирова-. нию, см ;

60 — продолжительность действия фермента, мин;

342 — молекулярная масса мальтозы, г (для перевода мкг в ммоль); а — количество исследуемых дрокжей в инкубационной смеси, г, Полученные по этой формуле результаты выражены в собственных единицах поляриметрического метода. За единицу активности мальтозы (, -глюкозидаэы) принимается такое количество фермента, которое за 1 мин при определенних условиях (рН и температуры) катализирует гидролиз 1 ммоля мальтозы.

Пример. На анализ берут хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae-821. Из них готовят рабочий раствор. 10 г исследуемых дрожжей вносят в колбу вместимостью 300 см и прибавляют 150 см дистиллированной воды.

Раствор перемешивают, на первую и вторую стадии анализа берут по 15 см исследуемого рабочего раствора дрожжей.

Первую стадию анализа осуществляют сразу после приготовления рабочего раствора в течение 10 мин. К 15 см исследуемого раствора дрожжей приливают 1 см соляной кислоты концентрацией 5,0 моль/дм, по 1 см сульфата цинка и желеэистосинеродистого калия с массовой долей 15 и 30 соответственно и 15 см раствора мальтоэы с массовой долей 1О .

Определяют угол поворота плоскости поляризации раствора после первой ста" дии Пк, который соответствует начальной концентрации мальтозы в растворе

31, 10

Вторую стадию осуществляют в течение 60.мин. К 15 см раствора мальтозы с массовой долей 1О приливают

15 см исследуемого раствора дрожжей, перемешивают и инкубируют субстрат с ферментом в течение 60 мин, затем инактивируют фермент добавлением 1 см соляной кислоты концентрацией

5,0 моль/дм и осаждают белки и коллоиды добавлением по 1 см сульфата цинка и желеэистосинеродистого калия с массовой долей 15 и 30 соответст1á 34336 венно. Раствор фильтруют, охлаждают до 0 С и измеряют угол поворота

0 плоскости поляризации раствора на второй стадии П, который соответствует концентрации непрогидролиэированной мальтозы 23,24

В инкубационной смеси находятся дрожки в количестве, r:

10 ° 15 и- — --1 О.

150

70 6 ЬП 70 6 7 86 554 97

Составитель Н.Алкеев

Редактор Н.Гунько Техред JI.ÎëHHHûê Корректор М.Самборская

Заказ 1930 Тираж 369 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Активность о6-глюкозидазы рассчитывают по формуле

Разность в значениях угла поворота плоскости поляризации 1П на первой и второй стадиях о

П П По 786 соответствует концентрации прогидролизированной мальтозы. !

Изобретение позволяет сократить время анализа в 2 раза (с 2 до 1 ч) и повысить точность определения Ы-глюкозидаэы.

Формула изобретения

Способ определения активности амилолитических ферментов путем проведения анализа с использованием суб5 страта мальтозы в две стадии, на одной из которых поляриметрированием определяют начальную концентрацию мальтоэы в исследуемой пробе дрожжей, а на другой осуществляют ферментативный гидролиз мальтоэы, инактивирование ее соляной кислотой и поляриметрическое определение углеводов и расчет величины активности ферментos, отличающийся тем, что, с целью ускорения определения е6-глюкоэидазы дрожжей и повьппения точности определения, из исследуемого субстрата на обеих стадиях перед поля 0 риметрированием осаждают белковые и коллоидные вещества смесью сульфата цинка и железистосинеродистого калия и дрожжи вводят в субстрат при концентрации мальтоэы, равной 10Х, для

25 проведения на второй стадии одновременно с ферментативным гидролиэом мальтоэы сбраживания обраэунл1ейся глюкозы.