Способ получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами

 

Изобретение относится к биотехнологии , касается способов получения липосом, коньюгированных с бактериальными антигенами , и может быть использовано в иммунологии и медицине для разработки вакцинных и липосомальных диагностических препаратов. Целью изобретения является упрощение способа и повышение качества целевого продукта за счетувеличеИзобретение относится к биотехнологии , в частности к способу получения липосом , коньюгированных с бактериальными антигенами, и может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и медицине для повышения иммуногенности бактериальных антигенов, создания вакцинных препаратов с использованием липосом в качестве носителя антигенов, а также для разработки липосомальных диагностических препаратов . ния эпитопной плотности белка на поверхности липосом при сохранении антигенных свойств белковых антигенов. Бактериальные антигены модифицируют фосфати- (М-оксисукцинимидилсукцинил)этаноламином одновременно с включением их в липосомы и с процессом формирования липосом из фосфолипидов. Для этого в водном растворе бактериальных антигенов диспергируют смесь, состоящую из фосфолипидов и модификатора, взятых в молярном соотношении 4-9:1 при массовом соотношении смеси и антигена 10-18:1, полученную суспензию инкубируют при комнатной температуре и перемешивании, а продукт отделяют центрифугированием. Диспергирование осуществляют либо путем инжекции раствора липидов в органическом растворителе, либо путем ультразвуковой обработки смеси, либо солюбилизацией липидов в растворе дезоксихолата натрия с последующим удалением детергента диализом . Способ обеспечивает практически полное (75-100%) сохранение антигенных свойств белковых антигенов. 3 з.п. ф-лы, 3 табл. Целью изобретения является упрощение процесса получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами, и повышение качества препарата за счет увеличения эпитопной плотности белка на поверхности липосом при сохранении антигенных свойств белковых антигенов. Пример 1. Смесь липидов (40 мг), состоящую из, фосфатидилхолина и фосфатидил- М-(М -оксисукцинимидилсукцисо с Os СЛ сл СЛ о Сл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) ()() ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 !

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4666536/13 (22) 23.03.89 (46) 15.06.91, Бюл. N 22 (71) Научно-исследовательский институт биомедицинской технологии (72) К,А.Шестаков, Г.И;Музя, Е.А.Драновская и В.И,Куликов (53) 576.8.097 (088,8) (56) Лукьянов А.Н., Клибанов A..Ë. и др. Ковалентное связывание фосфолипидов с белковой глобулой в системе обращенных мицелл. — Биоорганическая химия, 1988, т. 14, М 5, с.670 — 673. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМ, КОНЪЮГNPOBAHHblX С БАКТЕРИАЛЬНЫМИ АНТИГЕНАМИ (57) Изобретение относится к биотехнологии, касается способов получения липосом, коньюгированных с бактериальными антигенами, и может быть использовано в иммунологии и медицине для разработки вакцинных и липосомальных диагностических препаратов. Целью изобретения является упрощение способа и повышение качества целевого продукта за счет увеличеИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами, и может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и медицине для повышения иммуногенности бактериальных антигенов, создания вакцинных препаратов с использованием липосом в качестве носителя антигенов, а также для разработки липосомальных диагностических препаратов. (si)s А 61 К 9/50, 9/64, 39/02, 39/385 ния эпитопной плотности белка на поверхности липосом при сохранении антигенных свойств белковых антигенов. Бактериальные антигены модифицируют фосфатидил(Й Й вЂ” оксисукцинимидилсукцинил))этано-ламином одновременно с включением их в липосомы и с процессом формирования липосом из фосфолипидов. Для этого в водном растворе бактериальных антигенов диспергируют смесь, состоящую из фосфолипидов и модификатора, взятых в молярном соотношении 4-9:1 при массовом соотношении смеси и антигена 10-18:1, полученную суспензию инкубируют при комнатной температуре и перемешивании, а продукт отделяют центрифугированием. Диспергирование осуществляют либо путем инжекции раствора липидов в органическом растворителе, либо путем ультразвуковой обработки смеси, либо солюбилизацией липидов в растворе дезоксихолата натрия с последующим удалением детергента диализом. Способ обеспечивает практически полное (75 — 100%) сохранение антигенных свойств белковых антигенов. 3 з.п. ф — лы, 3 табл.

Целью изобретения является упрощение процесса получения липосом, коньюгированных с бактериальными антигенами, и повышение качества препарата за счет увеличения эпитопной плотности белка на поверхности липосом при сохранении антигенных свойств белковых антигенов.

Пример 1. Смесь липидов (40 мг), состоящую из фосфатидилхолина и фосфатидил — (N — (N — оксисукцинимидилсукци1655503 нил))этаноламина в молярном соотношении

9;1, растворенную в 30 мкл этанола, впрыскивают в раствор, содержащий 4 мг бруцеллезного протективного антигена (соотношение липид:белок 10:1) в 0,4 мл

0,9 -ного раствора NaCI. Полученную липидную дисперсию доводят до 0,5 мл путем добавления 0,9 -ного раствора NaCI и инкубируют при 37 С при перемешивании в течение 15 ч. Полученный препарат липосом, содержащий бруцеллезный протективный антиген, центрифугируют при 40000g в течение 2,5 ч, и в качестве липосом используют полученный после центрифугирования преципитат.

Пример 2. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, но молярное соотношение яичный фосфатидилхолин:фосфатидил — (N — (N -оксисукцинимидилсукцинил))этаноламин составляет

4:1.

Пример 3. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, но в качестве антигена используют чумной капсульный антиген Ф вЂ” 1.

Пример 4. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 2, но в качестве антигена используют чумной капсульный антиген Ф вЂ” 1.

Пример 5. К смеси липидов (77 мг), состоящей из яичного фосфатидилхолина и фосфатидил — (й — (й -оксисукцинимидилсукцинил))этаноламина в малярном соотношении 9:1, добавляют 2 мл 0,9 -ного раствора

NaCl, содержащего 7,7 мг бруцеллеэного, протектинового антигена (соотношение липид:белок 10:1), полученную суспензию встряхивают и обрабатывают ультразвуком при частоте 22 кГц и мощности 100-150 Вт в течение 5 мин, полученную липосомную суспензию инкубируют при 37 С при перемешивании в течение 5 ч, затем суспензию липосом центрифугируют (40000g; 2,5 ч), и в качестве препарата липосом используют полученный после центрифугирования супернатант.

Пример 6. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 5, но молярное соотношение яичный фосфатидилхолин:фосфатидил-(й-)М -оксисукцинимидилсукцинил))этаноламин составляет 4;1.

Пример 7. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 5, но в качестве антигена используется чумной капсульный антиген Ф-1.

Пример 8. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 6, но в качестве антигена используется чумной капсульный антиген Ф-1, Пример 9, К смеси липидов (54 мг), состоящей иэ яичного фосфатидилхолина и фосфатидил-(М-(И -оксисукцинимидилсукцинил))этаноламина в малярном соотноше5 нии 9:1, добавляют 0,3 мл 20 -ного раствора дезоксихолата натрия, полученную смесь инкубируют 30 мин при перемешивании. К полученной дисперсии прибавляют 1,0 мл раствора, содержащего

10 3,0 мг чумного капсульного антигена Ф-1 (соотношение липид:белок 18:1), полученную смесь инкубируют при 37 С и перемешивании в течение 3 ч, затем суспенэию подвергают диализу против дистиллирован15 ной воды (3х2 л) в течение 22 ч, затем суспензию липосом центрифугируют (40000 g;

2,5 ч), и в качестве препарата липосом используют полученный после центрифугирования преципитат.

20 Пример 10, Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 9, но молярное соотношение яичный фосфатидилхолин:фосфатидил — (N — (N -оксисукцинимидилсукцинил))эта нола мин составляет 4:1.

25 Пример 11. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, но в качестве липидов используют суммарные фосфолипиды яичного желтка.

Пример 12. Процесс проводят анало30 гично процессу, описанному в примере 1, но в качестве липидов используют дипальмитоилфосфатидилхолин.

B табл. 1 приведены сравнительные данные предлагаемого и известного спосо35 бов получения липосом, содержащих бактериальные антигены.

Из табл. 1 видно, что по числу стадий и времени, необходимого для осуществления процесса, предлагаемый способ значитель40 но превосходит известный. Предлагаемый способ имеет промышленную применимость, так как все 4 стадии, его составляющие, технологичны и могут быть достаточно просто оформлены в аппаратурном отноше45 нии.

Предлагаемый способ обеспечивает также высокое качество препарата липосом, Сравнительная характеристика липосом,конъюгированных белками, полученных

50 по предлагаемому и известному способам, приведена в табл. 2.

Из данных табл. 2 видно, что предлагаемый способ обеспечивает получение липосом, содержащих белки, характеризующихся высоким молярным соотношением белок;липид. Высокое молярное соотношение белок:липид обеспечивает оптимальную эпитопную плотность белкового антигена на наружной

1655503 поверхности липосом и вследствие этого повышает его иммуногенность, тогда как дальнейшее увеличение эпитонной плотности не приводит к существенным изменениям иммуногенных свойств липосом.

Предлагаемый способ обеспечивает практически полное (75-100 ) сохранение антигенных свойств белковых антигенов, тогда как известный способ приводит к снижению функциональной активности белка или к изменению его физико-химических свойств.

Предлагаемый способ получения липосом, конъюгированных с бактериальными анти генами обеспечивает максимально возможную сохранность антигенных свойств белка, экспонированного на наружной поверхности липосом. Наличие специфичного антигена на наружной поверхности липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами, подтверждено титрованием

БПА-содержащих липосом в реакции кольпреципитации с бруцеллезной поливалентной кроличьей сывороткой. При этом титр исходного бруцеллезного протективного антигена составляет 1:64000.

В табл. 3 приведены данные об антигенных свойствах бруцеллезного протективного антигена, конъюгированного с липосомами разными методами.

Как видно из табл. 3, предлагаемый способ обеспечивает относительную антигенную активность, сравнимую с антигенной активностью свободного бруцеллезного протективного антигена, тогда как другие способы в этом отношении малоэффективны.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно упростить процесс получения липосом, конъюгироввииых с бактериальными антигенами, и повысить их качество за счет повышенной эпитопной. плотности белка на поверхности липосом и сохранения при этом его антигенной активности.

Формула изобретения

1. Способ получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами, предусматривающий модификацию .белко10 ваго антигена фосфатидил -(N-(N -оксисукцинимидилсукцинилЦэтзноламином, формирование липосом иэ фосфолипидов, включение антигена в липосомы с последующим инкубированием и выделением целе15 вого продукта центрифугированием, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения качества целевого продукта за счет увеличения эпитопной плотности белка на поверхности липосом

20 при сохранении антигенных свойств белковых антигенов, модификацию и включение антигенов осуществляют одновременно с формированием липосом путем диспергирования смеси фосфатидил-(й — (й -оксисук25 цинимидилсукцинилНэтаноламина с фосфолипидами в молярном соотношении

4-9:1 в водной — солевом растворе белкового антигена при массовом соотношении антиген:смесь 1:10-18.

30 2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что диспергирование осуществляют путем ультразвуковой обработки при 22 кГц и мощности 100-150 Вт.

3. Способ по fl. 1, отл ич а ю щи и с я

35 тем, что перед диспергированием к смеси добавляют дезоксихолат натрия с последующим удалением детергента диализом.

4. Способ по и. 1, от л ич а ю щи и с я тем, что смесь растворяют в этаноле и дис40 пергирование осуществляют путем инжекции.

1655503 Таблица 1

Предлагаемый способ иве естный способ

Стадии процесса

Стадии процесса

Приготовление смеси липидов

0,2S

Получение липосом методом ипжекцин

0,1

3,0

Проведение реакции конзюгирования белка с липосомами

2,5

Ковалентное связывание белка с фосфатидил- М1,5

3-кратяап промывка белка ацетоном

Удаление остатка ацетона при пониженном давлении

Прнготогяение липидной смеси

24,0

0,5

14,0

Встраивание модифицированного белка в липосомы

Для иммуноглобулина С.

"«для о1,-химотрипсина.

"«"Для чумного капсулъного антигена Ф-1.

Получение системы обращенных мицелл диизооктнлсульфосукцината в гексане

Солюбчлизация белка в системе обращенных мицепл и иикубация мицеллярного раствора, содержащего белок

-(N -оксисукцинимидилсукцинилйэтаноламином в счстеме обращенных мицелл

Осаждение белка ацетоном и фентрифугиронание осадка белка

Получение чнпосом методом обращения фаэ и включение в липосомы флусрвсцентного маркера

Отделение несвязанного с липосомами белка центрифугировапием в ступенчатом градиенте фиколла-70

Время, пеобхочииое для выполнения . стадий, ч

Отделение несвязанного балка от липосом центрифугированием

Время, необходимое для выполнения стадий, ч

1655503

Таблица 2

Пок as атели

Значение показателе& при использовании типа белков нли белковых внтигенов ф "химо» трипсин

Чуно» капсуль антиге алле 9» прете» нный ан20-50 f5 6»26 . 50-100

Степень включения белка в . лнпосомы Х

65 80 30-40

- 5з5 Бе 4 Ое 18 1 э2, - 140-300-;

2,83,9 500

Отноиеннв белок /липид (моют/моль, 10

Сохранение на 80Х антнгенвьвс свойств

Сохранение, функциоиальной активности белка

-«Характеристики липосом приведены для разнык количеств фосфатндип-Ь-(Й окон" сукцнннмидилсукцинил) зтанапам1нв (1С 20мол.Хв составелипосойЬ, что соотвез» ц» ствует указанному в формуле изобретения соотноиению компонентов. Для бруцеллезного протектнвкого антнгена отнощение белок/лицнд приведено в мг белка/мг лнпида из-за гетерогенности антнгена по белковому составу. таблица 3

Относительная антнгенная активность

Способ получения препарата липосом

Свободный бруцеллезный антиген (БПА) ++++

BIIA пассивно сорбированный на наруаной поверхности фосфатиднлхлолиновых (ФХ) липосом, полученных методом ннаекцни

БПА, включенный в ФХ-липосомы, полученные методом инкекцни

БПА, нодифиплроланный пальмнтнновой кислотой и включенный в

ФХ-липосоны, полученные методом ннаекцнн

++++

Составитель О. Комарова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор В Гирняк .

Редактор И. Горная

Заказ 2010 Тираж 477 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 501

Сохраня- Умейьаеинв Функцнональется 60Х раствори-.. ная активкаталити- мости, бел- ность не чесхой ка в f00 раз изучалась активно- и балде в сти зависимости от степеин его модифи- . кации

BIIA, ковелентно связанный с наруаной поверхностью ФХ-липосом, содеравщих фосфатидил-fN-(N -оксисукциннмнднлсукцннил)) зтаноламнн, полученных методом ннавкции

БПА, козалентно связанный с

ФХ-липосомамн, содераащнмн

10 мол Х фосфатиднл-1л-(Б -окси сукцнннмнднпсукцинил)Д зтаноламн» на (предлагаеьый способ) 1003»»аое сохранение ли тига нных

csolcn бел.ковых .анти» генов