Способ определения танинофильности белков

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биохимии, молекулярной биологии и биоорганической химии, и может быть использовано при изучении структуры и функции белков, при исследовании модельных систем полифенолов и белков. Целью изобретения является упрощение и удешевление анализа. Способ осуществляется следующим образом. Распознавание танинсвязанных белков проводят после добавления различного количества танина в раствор многокомпонентной системы белков, электрофореза в полиакриламидном геле и проявлением белков раствором трихлоруксусной кислоты. Денситометрирование гелей позволяет выявить соотношение танинофильных и танинофобных белков. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)s С 07 К 3/02

ГОСУДАРСТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (. с о (21) 4622297/13 (22) 19.12.88 (46) 07.07.91. Бюл. ¹ 25 (71) Казахский научнб-исследовательский институт земледелия им. B.Р.Вильямса (72) И.M.Савич и Ю.В.Перуанский (53) 678.026.37(088.8) (56) Marks О. et а(.: J. Sci Food Agr„1987, ч,38, ¹2. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТАНИНОФИЛЬНОСТИ БЕЛКОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биохимии, молекулярной биологии и биоорганической химии, и может

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биохимии, молекулярной биологии и биоорганической химии, и может быть использовано при изучении структуры и функции белков, при исследовании модельных систем полифенолов и белков.

Цель изобретения — упрощение и удешевление анализа.

Танины — полифенольной природы соединения, найденные в большинстве растительных тканей, обладают способностью связывать и осаждать белки.

Способ состоит в том, что используют различные концентрации танина, которые добавляют к исследуемым белковым пробам, с последующим электрофоретическим определением белково-титановых комплексов.

;„, Ы„„1661182 А1 быть использовано при изучении структуры и функции белков, при исследовании модельных систем полифенолов и белков.

Целью изобретения является упрощение и удешевление анализа. Способ осуществляется следующим образом. Распознавание танинсвязанных белков проводят после добавления различного количества танина в раствор многокомпонентной системы белков, электрофореза в полиакриламидном геле и проявлением белков раствором трихлоруксусной кислоты. Денситометрирование гелей позволяет выявить соотно,шение танинофильных и танинофобных белков. 2 табл.

Пример 1. Из тонко размолотых зерен пшеницы и ячменя берут навеску 500 мг, приливают 5 мл 70%-ной этанола и экстрагируют белок при встряхивании в течение 1 ч. После центрифугирования при 7000g 15 мин надосадочную жидкость сливают в фарфоровую чашку и упаривают под феном до

1/3 — 1/4 первоначального объема, В полученный раствор добавляют сухую мочевину и сахарозу до 6 M и 20% соответственно, и определяют концентрацию белка по связыванию с красителем амида черным 10Б. После этого раствор делят на аликвоты по

200 — 250 мкл и в каждую добавляют танин возрастающих концентраций, ведя расчет на 500 мк-белка: :2,,5,,10, 15, 20, 25 мг танина. В контрольный образец танин не добавляют. После полного растворения танина (30 мин) белки в трехкратной повтор1661182

Таблица

Компоненты

Количество танина на 500 мкг белка

0 (кон- 2 тронь) 5 10 25

2О

Субфракция глиадина пшеницы (Богарная 56) 0>9

966737

8,9

21,0

31,7

3З,О

34,4 зз,з

28,6

30,4

30 6

41,8

25,8

29,3

34,0

28,2

23,6

28,!

21,2 30,9

28,3

34,7

39,5

29,7

Субфракция гордеина ячменя (Днепровский

435) 37,2

4,4

16,9

31,9

3,5

22,0

31,2

59,В

75,7

4,7

2,0

7,0

3,8

5,6

45,3

35 8

44,0

27,0

34,1 . 36,6 38,6

24,3 28,4 25,8

20,8

13,8

14,О

5,6 ности подвергают электрофорезу в 7,57

ПААГ с 6 M мочевины в стеклянных трубках диаметром 5 мм и длиной 80 мм. На трубку наносят 180-200 мкг белка, Первые 30 мин электрофорез ведут при силе тока 2 мА на 5 трубку и последующие 1,5 ч — при силе тока

4 мА на трубку, После ркончания электрофореза гели опускают в 10;4-ный раствор трихлоруксусной кислоты на 1,5 — 2 ч и сканируют на денситометре. Относительное содержа- 10 ние белковых субфракций определяют, суммируя площади соответствующих пиков и вычисляя долю каждого из них, приняв сумму за 100%, Пример 2. Из.зерна кукурузы удаляют 15 зародыш, эндосперм размалывают до тонкого порошка и на 1г муки приливают 10 мл

707,-ного этанола, содержащего 2 M мочевины. Экстракцию белков проводят в течение 1 ч при 60 С, После центрифугирования 20 при 7000g 15 мин надосадочную жидкость упаривают под феном до 1/4-1/5 первоначального объема,,цобавляют сахарозы до

20 %-ной концентрации и определяют белок по связыванию с красителем амидо чернь1м 25

10Б. Танин добавляют в различных количествах, как описано в примере 1.

Электрофорез белков проводят в 7,5,ь

ПААГ с 8 M мочевины. Остальная процедура аналогична описанной в примере 1. ЗО

Пример 3. Зерно сорго размалывают до тонкого порошка, отвешива1от 2 г и приливают 20 мл 70%-ного изопропанола с 4 M мочевины, предварительно проведя экстракцию холодной водой. Белки солюбилизиру- 35 ют в течение 1 ч при 60 С. После иентои4угирования и упаривания до 1/51/6 первоначального объема в растворы белков добавляют сахарозу и проводят дальнейшие операции, как описано в примере 2.

Проведенные исследования показывают, что воздействие танина на различные субфракции белков крайне неодинаково.

Результаты количественного соотношения белковых субфракций пшеницы, ячменя, кукурузы и сорго при различных концентрациях танина представлены в табл. 1 и 2, Из данных табл,1 и 2 следует, что наиболее чувствительными к действию танина (танинофильные белки) являются в-субфракции пшеницы и ячменя, и А — субфракции кукурузы и сорго.

Использование предлагаемого способа распознавания танинсвязывающих белков по сравнению с известными позволяет дифференцировать белки по их способности связываться с танином в MHol.oKoMlloHBHT ной системе, а также количественно вычислять соотношение танинофильных и танинофобных белков.

Формула изобретения

Способ определения танинофильности белков, включающий исследование взаимодействия белков с танинами в многокомпонентной системе с последующим учетом результатов, отличающийся тем, что, с целью упрощения и удешевления анализа, при исследовании взаимодействия к белковым пробам,цобавляют градиентное количество танина, проводят электрофорез белков в полиакриламидном геле, после чего денситометрически определяют количественное соотношение белковых компонентов, по которому судят о степени танинофильности.

1661182

Ю м (л сч

CV ECl с 4 л л л QQ м (О м л л О и б СО л л (0 л б — О

С 4 . л л т01 () Ю с 4

1 сч л О !

l х!

И

g I o (О (л л л л — м

1.О (б1 л л м м ь

Ю а л л л () О О л

М - 00

CQ л л л ч — (4,О (Ч л л QQ ь с (!

Ю л л сГ л — (4

1 Х - о д

1 И

1 о

1 а

1Ю сч л л л

Ю Ю

СЧ (Vl М

Ю м л л с 4 м м оо а л л М

ai o а — т 1,О и л л м

I

I Ъ, хю

W QO м м

l Я

5 о

A и 1

1

1 1

I !

1 O ((! I х ((! I х х х (C 1

I" I

1 о

Ш

Ь 1.— — — -3 о I (О 1 (C К

Х ((! х х э о (C l1l

QI х н х

N а

Х C (C а

& 2

0) Ъ о а

М (4 CO O л л л л

0 Л СО

Ю вЂ” м сч

Ch - ((1 ((1 л л л (ч Ю сч

Ю Q4 м c4 () с1 Q4 (с) QQ л л л ч— л Q (O IJ) л а;) С4 С 4 М 00

Ю и м л л л л л О с1 О Ь

° — СЧ СЧ CV чсо м 3 л л л л л

И Ю Ю О (ч м ч- ч»

QQ (4 с л л л л

Ю сп м м с 1 С 4 СЧ ч- М (lj х э х о а

В о (c а и о

Я

Йх

О, О

ra v д ы e r о аЕ

Рз Ом

u ucr

CQ QO (3 1 л л л (4

О Ь

Ь Q4 e4 В (сЪ 01 л л л л

О л о о 1

Ю (Ч с 1 (( л л л Ю (0

Ю с4 а

С 4 М\ М Ch СЧ