Штамм бактерий sеrrатiа маrсеsсеns - продуцент эндонуклеазы

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий S.MARCESCENS, продуцирующий неспецифическую эндонуклеазу (К.Ф.З. 1. 4. 9), которая может быть использована в научно-исследовательских работах по изучению противоопухолевых и противовирусных свойств эндонуклеазы при исследовании структуры хроматина для получения мононуклеотидов. Цель изобретения - получение беспигментного штамма SERRATIA MARCESCENS ВКПМ В-4870 (28 - 13), обладающего более высоким уровнем эндонуклеазной активности в культуральной жидкости. Полученный методом индуцированного мутагенеза беспигментный штамм S. MARCESCENS 28 - 13 обладает эндонуклеазной активностью, в 150 раз превышающей активность исходного штамма Вй - 211 АТСС - 9986, в 1,5 раза - активность пигментного штамма ВКПМ В-3857 с повышенной активностью эндонуклеазы. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sI)s С 12 М 9/14, 9/22

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4732457/13 (22) 19.07.89 (46) 07,07.91, Бюл. N 25 (71) Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова — Ленина и Вышневолоцкий завод ферментных препаратов (72) О.В.Порфирьева, О.А.Гимадутдинов, Д.В.Юсупова, А.П, Шарапов, И.П.Тюлина, О.С.Синявина и С.Ю.Ожерельев (53) 574.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

No 302367, кл. С 12 N 1/20, 1971, Авторское свидетельство СССР

¹ 1025725, кл. С 12 N 9/22, 1983.

Авторское свидетельство СССР

N 1549221, кл. С 12 N 1/20, 1988. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA

МАВСЕ$СЕИ$ — ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бакИзобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий S,marcescens, продуцирующий неспецифическую эндонуклеаэу (К.Ф.3.

1.4,9), которая может быть использована в научно-исследовательских работах по изучению противоопухолевых и противовирусных свойств эндонуклеазы при исследовании структуры хроматина для получения мононуклеотидов.

Цель изобретения — получение бесп игментного штамма S.màãñåsñåïs, обладающего более высоким уровнем эндонуклеазной активности в культуральной жидкости, „„Я2 „„1661214 терий S.marcescens, продуцирующий неспецифическую эндонуклеазу (К.Ф,З, 1.4.9), которая может быть использована в научноисследовательских работах по изучению противоопухолевых и противовирусных свойств эндонуклеазы при исследовании структуры хроматина для получения мононуклеотидов. Цель изобретения — получение беспигментного штамма Serratia

marcescens BKflM В-4870 (28-13), обладающего более высоким уровнем эндонуклеазной активности в культуральной жидкости.

Полученный методом индуцированного мутагенеза беспигментный штамм

$ marcescens 28-13 обладает эндонуклеазной активностью активностью, в 150 раз превышающей активность исходного штамма Вй-211 АТСС-9986, в 1,5 раза — активность пигментного штамма ВКПМ В-3857 с повышенной активностью эндонуклеазы, 1 табл.

Штамм получен методом двухэтапной обработки;

1 этап — облучение пигментного штамма

S.marcescens 211 Вй АТСС вЂ” 9986 ультрафиолетовым светом с последующим отбором колоний с наибольшей эндонуклеазной активностью;

Н этап — обработка мутанта, полученного на предыдущей стадии нитрозогуанидином и отбор наиболее активного продуцента.

Штамм S.marcescens В КПМ В-4870 (2813) имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные размером

1,5-2х0,8 — 1 мкм, одиночные, парные или со1661214

50 единенные в короткие цепочки, грамотрицательные, подвижные.

На мясопептонном агаре через 24 ч роста образует блестящие гладкие бесцветные колонии, выпуклые, с ровным краем, 5 диаметром 1,5 — 2 мм. На картофеле — блестящий бесцветный налет, Молоко свертывает, но не пептонизирует, желатин разжижает медленно.

Физиолого-биохимические и риз на ки.

Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу, сорбит, инозит, маннит, салицилат, Не ферментирует лактозу, адонит, дульцит, ксилозу, арабинозу, рамнозу. Не расщепляет мочевину, сероводород, индол не образует. Реакция

Фогес-Проскауэра положительная, реакция с метил-рот отрицательная.

Оптимальная температура для роста

28 — 30 С, рН среды 7,4 — 7,6.

Эндонуклеазная активность.

Эндонуклеазная активность через 24 выращивания на качалке 180 — 200 об.мин

-1 при оптимальной температуре достигает

450000-500000 виск. ед./мл, 90000-100000 опт. ед,/мл/ч, 150 — 160 мкм расщепленной

ДН К/мл/мин.

Ма;симальная эндонуклеазная активность наблюдается нэ 24 ч культивирования.

Эндонуклеазную активность определяют вискозиметрическим методом и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в 2%-ной HCIO<. Реакционная смесь объемом 1 мл содержит: 1 мг ДНК, 0,О7 M трис-HCI. рН 8,5, 0,007 M MgClz. 0,1 мл культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубируют 15 — 20 мин при 37 С, реакцию останавливают добавлением равного объема 4%-ной охлажденной НОО4.

Кислотонерастворимый материал удаляют центрифугированием на холоду при 6000д, 20 мин, В надосадочной жидкости после разведения в 20 раз измеряют оптическое поглощение при 260 нм на спектрофотометре СФ-16. 3а единицу активности принимают количество фермента, которое дает увеличение оптической плотности в опытных образцах по сравнению с контрольными (реакционная смесь без фермента), на одну оптическую единицу за час инкубации в пересчете на 1 мл культуральной жидкости (Аыо ед/мл/ч).

В качестве субстрата используют препараты высокополимерной ДНК из тимуса 5 теленка, выделенной по методу Кэя в модификации Бенинга, или коммерческие препараты высокополимерной ДНК.

Сравнительная характеристика активности внеклеточной эндонуклеазы штаммов

S,marcescens известных и предлагаемого в качестве продуцента эндонуклеазы на питательной среде следующего состава:

Глицерин 5 цитрат аммония 5

Двузамещенный фосфат калия 10

Сернокислый магний 0,5

Хлористый натрий 0,5

Сернокислое железо 0,025

Гидролизат казеина 1

Дрожжевой экстракт 3 рН среды 7,6 для получения эндонуклеазы представлена в таблице.

Пример 1. Получение штамма с повышенной эндонуклеэзной активностью.

Iэтап,,Исходный штамм Вй-211 АТСС9986 выращивают на мясопептонном агаре в течение 18 ч при 30 С. Выросшие клетки смывают 0,5%-ным физиологическим раствором, осаждают центрифугировэнием и ресуспендируют в 0,1 М Na-фосфатном буфере до оптической плотности 0,12 — 0,15 при

650 нм. Полученную суспензию клеток облучают бактерицидной ультрафиолетовой лампой БУФ-2 в течение 100 с, К облученной суспензии добавляют мясопептанный бульон — 1/3 объема суспензии и инкубируют в темноте в течение 3 ч при 30 С. После инкубирования клетки высеивают в чашки

Петри с мясопептонным агаром, в который добавлен индикатор для выявления продуцентов эндонуклеазы, содержащий

О,б мг/мл дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и 0,01 /, толуидинового голубого. окрашивающего среду с ДНК с голубой цвет. Вокруг колоний, выделяющих эндонуклеазу, через 24 ч роста в результате гидролизэ ДНК образуется ореол розового цвета. Отбирают колонии с наибольшими по сравнению с контролем зонами ДНК-азной активности.

Il этап. Клетки наиболее активного мутанта, отобранного на I этапе выращивают на мясопептонном бульоне до середины экспоненциальной фазы (ОПт о = 0,50). осаждают центрифугированием, отмывают отсреды 0,1 M фосфатным буфером, рН 5.5.

Клетки суспендируют в том же буфере до

ОПТ = 0,40. К полученной р спензии добавляют N — метил — нитро N — нитрозогуанидин (Н Г ) мг/мл в 0,1 M цитратном буфере, рН 5,5) до конечной концентрации 75 мкг/мл.

Клетки инкубируют в течение 30 мин в водяной бане при 37 С. Затем клетки осаждают центрифугированием, промывают 0,1

M фосфатным буфером, рН 7, чтобы удалить

НГ,.и рассеивают разведением на чашки с индикаторной средой с ДН К. Отбирают бес1661214

Эндонуклеазная активность различных штаммов S, marcescens

Штамм

Активность эндон клеазы в к льт альной жи кости опт. ед. /мл/ч виск, ед/мл мкМ расщепленной

Н К/мл/мин

41 (пигментный ) Ви — 211 АТСС вЂ” 9986 (пигментный ) 44 (беспигментный ) 24 (беспигментный ) ВКПМ В вЂ” 3857 (пигментный ) 28 — 13 (беспигментный, рекомендуемый ) 1000

160

0,5

3000-3500

50000-60000

80000-90000

620-700

3500-3950

13000-15000

1 — 1,5

14 — 16,5

21 — 25

300000-350000

60000-70000

100 — 116

450000-500000

90000-100000

150 — 160

Составитель И. Чаплина

Редактор М, Стрельникова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т, Палий

Заказ 2097 Тираж,, Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 пигментные колонии с наибольшими зонами гидролиза ДНК. Все отобранные мутанты проверяют на эндонуклеазную активность на жидкой среде.

Наибольшая активность выявлена у мутанта 28 — 13.

Пример 2. Изучение эндонуклеазной активности.

Исходный штамм Вй — 211 АТСС-9986 и штамм 28 — 13 выращивают в течение суток в пробирке со скошенной средой указанного состава, смывают 0,5 -ным физиологическим раствором и засевают из расчета 1 мл инокулята на 100 мл среды в колбу объемом

1 л с 200 мл среды.

Выращивание ведут на качалке (200 об/мин) при оптимальной температуре 30 С в течение 24 ч. Затем бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 60009, 20 мин. В надосадочной жидкости определяют эндонуклеазную активность вискозиметрически,и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в 2 -ной

HCI04. Результаты представлены в таблице, Полученный штамм отличается от исходного Вй-211 АТСС-9986 большими размерами клеток, более медленным разжижением желатина, от штамма ВКПМ

5 В-3857 — отсутствием пигментообразования.

Эндонуклеазная активность штамма

28 — 13 в 150 раэ превышает активность исходного штамма и в 1,5 раза штамма

10 В КПМ вЂ” В-3857. Наиболее высокая активность штамма 28-13 достигается на 24-й час роста.

Использование предлагаемого штамма 28 — 13 в качестве продуцента эндонукле15 азы позволяет повысить эндонуклеазную активность за период одной ферментации на 150 g, по сравнению с культивированием на той же среде штамма ВКПМ В-3857. Преимуществом предлагаемого штамма по

20 сравнению со штаммом ВКПМ В-3857 является стойкое отсутствие пигментации.

Формула изобретения

Штамм бактерий Serratia marcescens

25 В КПМ В-4870 — продуцент эндонуклеазы.