Способ определения сшивок днк-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов

 

Изобретение относится к физико-химическим методам определения сшивок ДНК-белок под влиянием физико-химических агентов и может найти применение при поиске препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки. Целью изобретения является повышение точности определения и ускорение способа. В основе метода лежит количественное определение УФ-индуцированных сшивок ДНК-белок в присутствии и отсутствии исследуемых веществ посредством диссоциации раствором 1,5 М NACL в 1% ДДС, разделения на ДНК и ДНК-белковый комплекс центрифугированием на холоду и регистрации спектра гельфильтрации раствора облученного ДНП через колонку с полиакриламидным гелем АСА-54. Для количественной оценки выхода сшивок ДНК-белок (N) используется соотношение площадей пиков в хроматограмме в контроле (S<SB POS="POST">к</SB>) и после УФ-облучения (S<SB POS="POST">уф</SB>) по формуле (S<SB POS="POST">к</SB> - S<SB POS="POST">уф</SB>) / S<SB POS="POST">к</SB> <SP POS="POST">.</SP> 100% = N. Эффективность действия химического соединения может быть охарактеризована двумя способами: по расчетной величине N, а также по кинетической оценке выхода сшивок от дозы облучения - константе K, определяемой как тангенс угла наклона линейного участка кривой зависимости N от дозы облучения. 1 табл.

союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

6ЙЖ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4424607/13 (22) 13.05,88 (46) 23.07.91. Бюл. N 27 (71) Всесоюзный заочный политехнический институт (72) B.М. Жильцова, Е.М. Миль и Г.Я. Коломийцева (53) 577.21 (088.8) (56) Analyt. Biochem, 1985, ч. 149, р. 575-581. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СШИВОК

ДНК-БЕЛОК, ОБРАЗУЮЩИХСЯ В ХРОМАТИНЕ ПОД ВЛИЯНИЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ (57) Изобретение относится к физико-химическим методам определения сшивок ДНКбелок под влиянием физико-химических агентов и может найти применение при поиске препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки. Целью изобретения является повышение точности определения и ускорение способа, В основе

Изобретение относится к физико-химическим методам определения сшивок ДНКбелок под влиянием физико-химических агентов и может найти применение при поиске препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки.

Целью изобретения является повышение точности определения и ускорение способа.

Способ заключается в том, что используют УФ-облученный биополимер ДНП.

Облучение растворов ДНП УФ-светом.приводит к специфической реакции — образованию сшивок ДНК-белок в местах контактов. Ж „1664844 А1

УФ-индицированных сшивок ДНК-белок в присутствии и отсутствии исследуемых веществ посредством диссоциации раствором

1,5 M NaCI в 1% ДДС, разделения на ДНК и

ДН К-белковый комплекс центрифугированием на холоду и регистрации спектра гельфильтрации раствора облученного ДНП через колонку с полиакриламидным гелем

АСА-54. Для количественной оценки выхода сшивок ДНК-белок (n) используется соотношение площадей пиков в хроматограмме в контроле ($,) и после УФ-облучения (Syg) по формуле (Як-Буф)/5, х 100% = n. Эффективность действия химического соединения может быть охарактеризована двумя способами: по расчетной величине и, а также по кинетической оценке выхода сшивок от дозы облучения — константе К, определяемой как тангенс угла наклона линейного участка кривой зависимости п от дозы облучения.

1 табл.

ДНК и гистонов, что.сопровождается увеличением количества нерастворимого в 1%ном растворе додецилсульфата натрия и 1,5

М хлориде натрия ДНК-белкового комплекса. и уменьшением количества свободной

ДНК. Данное обстоятельство используется для определения степени сшивания ДНКбелок и диссоциации свободной ДНК из

ДНП в зависимости от дозы облучения в присутствии испытуемых химических соединений, В основе метода. лежит количественное определение УФ-индуцированных сшивок

ДНК-белок в присутствии и отсутствии исс1664844 ледуемых веществ посредством регистрации спектра гельфиль1рации раствора ДНП через колонку с полиаvðèламидным гелем

A CA-54.

Для количественной оценки выхода 5 сшивок ДНК-белок используется соотношение площадей пиков в хроматограмме в контроле (S») и при УФ-облучении (Sy4,) после прохождения колонки с ACA-54 по формуле (S» пуф)/S» 100 = и. 10

Пример, Препараты ДНП выделяют из свежей печени крыс. Для извлечения ядер печень гомогенизируют в растворе 0,1

M хлорида натрия и центрифугируют при

4000 o6/мин в течение 10 мин. Надосадоч- 15 ную жидкость сливают, осадок вновь гомогенизируют в 10-кратном объеме раствора

0,14 M КаС1 с последующим центрифугированием взвеси при 4000 об/мин в течение

15 мин, Операцию промывания осадка про- 20 водят 5-6 раэ с целью удаления липидов и растворимых белков, Для извлечения ДНП полученный осадок ядер подвергают гемолизу в дистиллированной воде (рН 6) и оставляют на холоду 25 в течение 30 мин. Первый гемолизат сливают, а промытый осадок вновь заливают дистиллированной водой и оставляют на мешалке (3000 об/мин) на холоду в течение 12 ч. 30

Полученный гелеобразный ДНП осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 18000 об/мин, Все операции по получению ДНП осуществляют при 4 — 6 С. 35

Полученный препарат характеризуют по количественному соотношению ДНК: белок методом Лоури. Содержание белка в препаратах ДНП составляет 50%.

Образцы ДНП в трис-буфере 0,05 М, рН 40

7,4 с исходной оптической плотностью при

260 нм, равной 1, тщательно смешивают с растворами препарата СД-б различной концентрации в той >ке буферной системе и подвергают облучению разными дозами 45

УФ-света с А 254 .нм при температуре

22,5 С. Мощность лампы 5,7 10 кБ/мм с.

13 2.

Для отделения сшитого облучения комплекса ДН К-белок к 1 мл облученного в присутствии препарата СД-6 ДНП добавляют 50

0,15 мл 1 -ного раствора додецилсульфата натрия (ДДС) и 0,4 мл 5М Na CI, смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре и 2 ч при 4ОС, а затем подвергают центрифугированию на холоду в течение 30 мин 55 при 8000 об/мин, Надосадочную жидкость отлеляю- и анализируют методом гельфильтрации через колонку размером 5х60 мм с полиакриламидным гелем, На колонку наносят 0,1 мл исследуемой жидкости, в качестве элюента используют 0,05 М трис-буфер, рН 7,4. По соотношению площадей пиков хроматограммы S»" и Зуф"Р (в контрсле и после облучения соответственно) находят количество сшивок ДНК-белок в присутствии СД-б. Оно составляет 32 для концентрации СД-6 10 М при дозе УФ-све-5 та 4,8 10 Дж/м, Величина константы К, 2 найденная для этой же концентрации препарата, составляет 3,0 10 2. Контроль.

К 1 мл образца ДНП в трис-буфере 0,05

М, рН 7,4 с исходной оптической плотностью при 260 нм, равной 1, добавляют 0,15 мл буфера и подвергают облучению разными дозами УФ-света с Л 254 нм при

22,5 С.

Для отделения сшитого комплекса ДНКбелок к 1 мл облученного раствора ДНП добавляют 0,15 мл 1%-ного раствора ДДС и

0,4 мл 5М NaCI, смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре и 2 ч при 4 С, а затем центрифугируют на холоду в течение

30 мин при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость отделяют и анализируют методом гельфильтрации через колонку. На колонку наносят 0,1 мл исследуемой жидкости, в качестве элюента используют 0,05 M трис-буфер, рН 7,4. По соотношению площадей пиков 1 Sp — необлученного ДНП и Яуф"— облученного разными дозами УФ-света контрольного раствора ДНП (без препарата) находят количество сшитого облучением комплекса ДНК-белок (n) и константу К, которые составляют соответственно 55 и1,.10

По предлагаемой методике изучают влияние на выход УФ-индуцированных сшивок ДНК-белок ряда соединений: СД-30, парабензохинона, гидрохинона, цистеина и

Ар

В таблице приведены значения и и Kдля исследованных соединений в интервале наиболее эффективных концентраций 10

10 М, Как видно, наблюдается корреляция изменения значений и и К для исследованных веществ и эффективность их действия в равной степени может быть определена каждым из предложенных параметров, а величина константы позволяет оценить степень защитного или сенсибилизирующего действия препарата по отношению к образованию сшивок.

Предлагаемый способ используют в качестве тест-объекта УФ-облученный ДНП, который биологическим аналогом хроматина клетки, подвергнутого действиям экологического облучения. Известна функция

1664844

Составитель Н,Кузенкова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М,Кучерявая

Редактор Н.Рогулич

Заказ 2366 Тираж 389 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4!5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

ДНП как носителя наследственной информации клетки, накоплено значительное количество данных, показывающих,.что

ДНК-белковые сшивки являются важной компонентой УФ-повреждений в клетке. 5

Например, обнаружены ДНК-протеиновые сшивки в нормальных фибробластях кожи, облученных солнечным светом. Поэтому весьма важной является задача выявления веществ-протекторов ДНК-белковых сши- 10 вок.

Кроме того, предлагаемый способ обеспечивает высокую эффективность в фотохемотерапии различных патологий химических агентов, вызывающих избира- 15 тельные сшивки-ДНК-белок. В связи с этим

УФ-облученный ДНП может быть использован для скрининга биологических препаратов, избирательно действующих на генетический аппарат клетки и обладающих 20 как протекторными, так и сенсибилизирующими действиями по отношению к образованию сшивок ДНК-белок.

Преимуществом способа является также быстрота и доступность получения рас- 25 творимого хроматина; Использование хроматографического метода анализа УФ.облученного препаратов ДНП позволяет с большой точностью при простоте и непродолжительности анализа получать надежную информацию о количестве сшивок

ДНК-белок. Кроме того, предлагаемый способ анализа биологической активности физико-химических соединений по сшивкам

ДНК-белок дает возможность работать с микроколичествами исследуемых веществ.

Формула изобретения

Способ определения сшивок ДНК-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов, предусматривающий диссоциацию ДНКбелкового комплекса, разделение ДНК-белкового комплекса на свободную ДН К и ДНК, связанную с белком,с последующим анализом сшивок ДНК-белок по количеству несвязанной ДНК, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения и ускорения способа, диссоциацию осуществляют раствором 1,5 M NaCl 17; ДДС, разделение на свободную ДНК и ДНК-белковый комплекс проводят центрифугированием на холоду, а количество несвязанной

ДНК определяют на колонке, заполненной акриламидной агарозой.

Способ определения сшивок днк-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов Способ определения сшивок днк-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов Способ определения сшивок днк-белок, образующихся в хроматине под влиянием физико-химических агентов 

 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при проведении клинических, химико-токсикологических и судебно-химических исследований

Изобретение относится к химической физике

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения активности ферментов, и может быть использовано для определения активности ферментов и содержания аминного азота в аминокислотном анализе и протеолизе

Изобретение относится к биохимии растений и может быть использовано в работах по генетике и селекции зерновых и зернобобовых культур при оценке качества семенного материала

Изобретение относится к получению чувствительных элементов для аналитических систем для определения палладия и может быть использовано при анализе сточных вод, производственных растворов

Изобретение относится к способам определения цианатов в сточных водах после обезвреживания их хлорпродуктами и позволяет повысить чувствительность определения в 10 раз

Изобретение относится к устройствам для изучения кинетики химических реакций методом остановленной струи и позволяет увеличить быстродействие устройства

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения бромидов, .и может быть использовано для повьшения чувствительности , селективности и экспрессности способа

Изобретение относится к области химической, молекулярной физики и оптики

Изобретение относится к аналитической химии цинка и позволяет повысить чувствительность, точность и экспрессность анализа

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и иммунологии, и касается лечения В-клеточной лимфомы

Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептиду, несущему эпитоп BNP(1-32) человека, для получения лигандов, направленных против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, где указанный полипептид имеет формулу a 1 − R 1 − X 1 − F G R K M D R − X 2 − R 2 − a 2 . Раскрыто применение указанного полипептида для получения лигандов, направленных против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека и для получения гибридомы, которая секретирует моноклональное антитело, направленное против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека. Раскрыт способ получения гибридомы, которая секретирует моноклональное антитело, направленное против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, а также полученная гибридома. Раскрыт лиганд, специфичный к эпитопу с последовательностью FGRKMDR, а также его применение для детектирования в биологическом образце BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека. Раскрыт способы детектирования в биологическом образце BNP(1-32) человека или производного proBNP(1-108) человека, способ in vitro диагностики, прогноза, стратификации риска или последующего наблюдения отдаленных результатов сердечной и/или сосудистой патологии у индивидуума, а также способ in vitro диагностики инсульта у индивидуума с использованием указанного лиганда. Раскрыт мультиэпитопный калибратор, предназначенный для получения калибровочных кривых для анализов BNP(1-32), proBNP(1-108), а также набор для детектирования BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека. Изобретение позволяет эффективно детектировать сердечные и/или сосудистые патологии у индивидуума. 12 н. и 3 з.п. ф-лы, 17 ил., 12 табл., 18 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus α-продуцент моноклональных антител, специфичных к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (GCSF) человека, депонированный в Специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии РАН под номером РККК (П) 662 Д. Изобретение позволяет расширить арсенал штаммов, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к GCSF, используемые для научно-исследовательских и медицинских целей. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, генетической инженерии и биотехнологии. Предложен способ обеспечения безопухолевой тканезаместительной терапии на основе получаемых из взрослых соматических клеток индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), где последние генетически модифицируют при помощи искусственной хромосомы (ИХ), несущей бицистронную кассету с геном-самоубийцей и геном чувствительности к антибиотику под контролем регуляторного элемента, специфичного для плюрипотентных стволовых клеток, при этом модифицированные иПСК отбирают в присутствии соответствующего антибиотика, подтверждают отсутствие интеграции ИХ в геном иПСК, вводят в организм реципиента напрямую, без предварительной дифференцировки in vitro, через 1-14 дней реципиентам проводят 5-10-дневный курс терапии индуктором токсичности продукта гена-самоубийцы. Изобретение позволяет свести к нулю риск ракового перерождения трансплантированных клеток и появления тератом, повысить клиническую эффективность восполнения клеточной массы поврежденного органа или ткани, сократить время ожидания для потенциальных реципиентов. 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его функциональному фрагменту, направленным против эпитопа стафилококка золотистого, а также к их применению для обнаружения стафилококка золотистого. Раскрыта линия клеток гибридомы, которая продуцирует вышеуказанное антитело, где линия клеток гибридомы является клеточной линией, хранящейся в DSMZ под инвентарным номером DSM АСС2987. Также изобретение относится к способу лечения или профилактики, который содержит введение вышеуказанного антитела или его функционального фрагмента человеку или животному, где лечение является лечением инфекции человека или животного, где инфекция вызвана стафилококком золотистым, и где профилактика является профилактикой такой инфекции, вызванной стафилококком золотистым. Изобретение позволяет эффективно лечить инфекцию человека, вызванную стафилококком золотистым. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

Изобретение относится к биохимии. Описано моноклональное антитело, которое специфически связывается с липоарабиноманнаном кислотоустойчивых бацилл, в частности с липоарабиноманнаном туберкулезной бациллы. Описанное антитело является моноклональным антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соединенные через линкер. Вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR1-CDR3, показанные в (а)-(с), и легкой цепи содержит CDR1-CDR3, показанные в (d)-(f): (а) CDR1 тяжёлой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID No:1, (b) CDR2 тяжёлой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID No:2, (c) CDR3 тяжёлой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID No:3, (d) CDR1 лёгкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID No:4, (e) CDR2 лёгкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID No:5, и (f) CDR3 лёгкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID No:6. Также описаны реагент, набор и устройство, содержащие описанное антитело. Изобретение расширяет арсенал средств для обнаружения микобактерий. 11 н. и 7 з.п. ф-лы, 19 ил., 5 табл., 12 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к лекарственному средству для лечения или профилактики CAPRIN-1 экспрессирующего рака. Также раскрыты антитела, обладающие иммунологической активностью по отношению к белку CAPRIN-1, лекарственное средство, содержащее указанные антитела, и моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком CAPRIN-1. Раскрыт способ лечения или профилактики CAPRIN-1 экспрссирующего рака. Изобретение позволяет эффективно лечить опосредуемый CAPRIN-1 рак. 10 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к лекарственному средству для лечения или профилактики CAPRIN-1 экспрессирующего рака. Также раскрыты антитела, обладающие иммунологической активностью по отношению к белку CAPRIN-1, лекарственное средство и лекарственная комбинация, содержащие указанные антитела, и моноклональное антитело, которое специфически связывается с белком CAPRIN-1. Раскрыты способ лечения или профилактики CAPRIN-1 экспрссирующего рака. Изобретение позволяет эффективно лечить опосредуемый CAPRIN-1 рак. 8 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, которое специфически связывается с белком CAPRIN-1. Также раскрыты моноклональное антитело, которое обладает иммунологической реактивностью по отношению к белку CAPRIN-1, антитела, которые специфически связываются с белком CAPRIN-1, лекарственное средство, содержащее указанные антитела, для лечения или профилактики CAPRIN-1 экспрессирующего рака. Раскрыты способы лечения или профилактики CAPRIN-1 экспрессирующего рака, с применением заявленного антитела и вышеуказанного лекарственного средства. Изобретение обладает способностью специфически связываться с CAPRIN-1, что позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с экспрессией белка CAPRIN-1. 10 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил, 7 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к мышиной гибридоме AMACR с регистрационным номером ВКПМ H-166, которая является продуцентом моноклонального антитела, выявляющего цитоплазматический белок человека альфа-метилацил-коэнзим А рацемазу AMACR в клетках аденокарциномы простаты и в клетках других органов, содержащих данный антиген. Изобретение позволяет эффективно получать антитела, специфически выявляющие альфа-метилацил-коэнзимА рацемазу человека (AMACR) методами иммуноцитохимии, иммуногистохимии, иммуноблотирования и иммунофлуоресценции. 4 ил., 3 пр.

Изобретение относится к областям фотометрии и может быть использовано для определения содержания билирубина в крови
Наверх