Способ получения замещенных 5 @ -(2-гидроксибензоил) производных пуриновых нуклеозидов

 

Изобретение относится к способу получения замещенных 5<SP POS="POST">Ъ</SP> = (2-гидроксибензоил)производных пуриновых нуклеозидов - специфических необратимых флуоресцентных ингибиторов пуриннуклеотидзависимых ферментов. Цель - создание новых производных указанного класса. Процесс ведут реакцией замещенной 2-гидроксибензойной кислоты с тионилхлоридом при молярном соотношении реагентов 1 : (1,5 - 3) в среде безводного диоксана или тетрагидрафурана с последующей обработкой раствором аденозина или гидрохлорида гуанозина в гексаметилтриамиде фосфорной кислоты при молярном соотношении исходной кислоты и нуклеозида (2 - 3) : 1 ( в случае аденозина) и (3 - 4) : 1 (в случае гидрохлорида гуанозина) и выделением целевого продукта (переосаждением или препаративной тонкослойной хроматографией) следующей общей ф-лы 2 - OH, 4 - R<SB POS="POST">1</SB>, 5-R<SB POS="POST">2</SB> - C<SB POS="POST">6</SB>H<SB POS="POST">2</SB> -C(O)-O @ , где B -6-аминопуринил-9, а) R<SB POS="POST">1</SB> - H, R<SB POS="POST">2</SB> - фторсульфогруппа

б) R<SB POS="POST">1</SB> - иодацетамидо или 2, 5-дигидро-2, 5-диоксопирролил-1 и R<SB POS="POST">2</SB> - H или B - 2-амино-1, 6-дигидро-2-оксопупуринил-9, в) R<SB POS="POST">1</SB> - H и R<SB POS="POST">2</SB> - фторсульфогруппа

г) R<SB POS="POST">1</SB> - иодацетаамидо и R<SB POS="POST">2</SB> - H. Выход, %

т. пл., °С

брутто-ф-ла: а) 27,5

165 - 166

C<SB POS="POST">17</SB>H<SB POS="POST">16</SB>FN<SB POS="POST">5</SB>O<SB POS="POST">8</SB>S

б) 47

177 - 179

C<SB POS="POST">19</SB>H<SB POS="POST">19</SB>JN<SB POS="POST">6</SB>O<SB POS="POST">7</SB>

в) 12

210 - 212

C<SB POS="POST">21</SB>H<SB POS="POST">1</SB>008N<SB POS="POST">6</SB>O<SB POS="POST">8</SB>

г) 13

179

C<SB POS="POST">17</SB>H<SB POS="POST">16</SB>FNO<SB POS="POST">9</SB>S. ЭФФЕКТ ИНГИБИРОВАНИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ ВЫШЕ ЧЕМ У ИЗВЕСТНОГО. 3 ТАБЛ.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

В (21) 4610294/04 (22) 30.11.88 (46) 07.08;91. Бюл. М 29 (71) МГУ им.M.Â.Ëîìîíoñîâà (72) Ю.В.Храпов, Н.Я.Пинчук и Л,А.Баранова (53) 547.455.07 (088.8) (56) СОИпвап R.F., Pal P.К., Wiatt JЛ . Methods

In Enzymology(Ed.S.P.CoÈowIck, N.0. Kaplan)

М 46, Academic Press, N А San-Fransisco, London, 1977, р,240-249.

Pal P.К., Reischer R,J., Wechter W.I., Colman R.F. А New Affinlti Label for

Guanosine Nucleotide Sites ln Proteins. — I.

Biol.Chem., 1978, v.253, N 19, р.6644-6646; (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАМЕЩЕННЫХ

5 (2-ГИДРОКСИБЕНЗОИЛ)ПРОИЗВОДНЫХ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ (57) Изобретение относится к способу получения замещенных 5 -(2-гидроксибензоил)производных пуриновых нуклеоэидов— специфических необратимых флуоресцентных ингибиторов пуриннуклеотидэависимых, ферментов. Цель — создание новых производных указанного класса. Процесс ведут реакцией замещен ной 2-гидроксибензойной кислоты с тионилхлоридом при моИзобретение относится к способу получения новых химических соединенийзамещенных 5 -(2-гидроксибензоил)производных пуриновых нуклеозидов общей формулы

"г о

Я, Q С вЂ” 0

Olk 0H Off

„„ „„1668367 А1 (я>з С 07 Н 19/167, С 12 N 9/99 лярном соотношении1:(1,5-3) в среде безводного диоксана или тетрагидрофурана с последующей обработкой раствором вденозина или гидрохлорида гуанозина в гексаметилтриамиде фосфорной кислоты при малярном соотношении исходной кислоты нуклеозида (2-3):1 (в случае аденоэина) и (3-4):1 (в случае гидрохлорида гуанозина) и выделением целевого продукта (переосаждением или препаративной тонкослойной хроматографией) следующей общей ф-лы

Я

2-ОЬ ч R 5 Rg-СбН2-CX)-О- / 1-

0il Ы 1 где В-6-аминопуринил-9, а) Я1-Н, Яг — ф орсульфогруппа, б) R1 èîäàöåòàìèä или 2,5дигидро-2.5-диоксипирролил-1 и Я2-Н или

 — 2-амин-1,6-дигидро-2-оксо- пуринил-9, в)

R1-Í и Яг — фторсульфогруппа; г) R1-иадацетаамидо и Яг-H. Выход,7; т.пл., С; бруттоф-ла: а) 27,5; 165-166; C1vH1sFNsOsS; б) 47:

177-179; С19Н19ЛйбО7; в) 12; 210-212;

Cz1H1sNs0s; г) 13; 179; CtzHisFNOgS. Эффект ингибирования аденилатциклаэы выше, чем у известного, 3 табл. где  — 6-аминопуринил-9; R1 — атом водорода; Я2 — фторсульфогруппа иода цетамидогруппа или2,5-дигидро2,5-диоксопирролил-1; Rz — атом водорода или  — 2-амина-1,6-дигидро-2-оксопуринил-9; R1 — атом водорода; Rz -фторсульфогруппа; R1 — иодацетамидогруппа; Rz — атом водорода, которые могут быть использованыы в биохимии, биофизике и молекулярной биологии в качестве специфических необра16683 Ы тимых флуоресценTíhlõ ингнбиторов пуриннуклеотидзависимых ферментов, Кроме того, наличие гидроксильной группы в составе бензоильного фрагмента молекулы предполагает возможность достаточно простого синтеза радиоактивно-меченых производных получаемых соединений путем введения атома 12 J в положение 3 бензольного цикла, Цель изобретения — разработка способа получения новых реакционноспособных

5 -бензоиппроизводных пуриновых нуклеозидов, Обладающих фг!уорo0öåíTIIüIMè свойствами. указанная цель достигается предлагаемым способом получения замещенных 5 -(2Гидроксибензоил)производных пуриновых ! I Jêël 0:.Iëä0þ укязан HÎÉ фоpM ëы 1, закл !Очя

IQi.;!èì0ÿ I3 TDM что соответствующую замещенную 2-гидроксибензойну!о кислоту вводят по взаимодействие со свежеперегнянным тионилхлоридом при малярном 00отнош!Энии реагентов, равном 1;(1,5-3) соответственно, в среде безводного диоксаня при комнатной температуре, после чего упяривяют при пониженном давлении (2030 мм рт.ст.), повторно упарива!От с безводным диоксаном или тетрагидро Ьураном и остаток непосредственно вводят во взаимодействие с раствором аденозиня или гидрохпорида гуанозина в безводном гексаметилтриамиде фосфорной кислоты при малярном соотношении реагентов; исходная кислота — нуклеозид, равном (2-3):1 в случае аденозина и (3-4);1 в случае гидрохлорида гуанозина, с последующим выделением целевого продукта известными приемами (переосажден. .ем или препярати в ной тон косл ой ной хроматографией).

Пример 1. 5 -(2-Гидрокси-5-(фторсупьфон ил)оензОил)яде г!Ози и.

К pa(:Tâ0pó 0,615 г (2,8 ммоль) 2-гидрокси-5-(фторсупьфонил)бензойной кислоты в

5 мл безводного д!локсаж;,добавл !!От 0,4 мл (5,6 !лмu)!ь) свежеперег!!анного тионилхлорида, !1рибавляют 2 капли безвОДноГО Диметилформамида и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, защищая от

Доступа вла Ги. После этОГО I !0flучен н ый оас

TD0p оставляют на 20 ч при комнатной температуре, затем упаривают при пониже!!ном давлении до объем: 0,5 мл.

Остаток повторно рястворя!от v. 2 мл безводI!0I0 Диоксана и упаривают до объема 0,5 мл, Полученный хлорангидрид без дополнительной очистки используют ня следующей стадии.

Раствор 249 мг(0,933 ммоль) аденозина в 2,5 мл безводного гексаметилтриамида фосфорной кислоты добявля!от к хлорангидриду, 2-гидрокси-5-(фторсульфонил)бензойной кислоты, полученному на предыдущей

СТЯДИИ.

Реакционную смесь перемешивают 12 ч при комнатной температуре, защищая от доступа влаги, затем экстрагируют гексаном (3x10 мп). Нижний слой отделяют, сме-, шивают с 2 мл безводного этанола и высажива!от целевой продукт добавлением

10 мл охлажденного безводного диэтилового эфира. Выделившийся осадок затирают с0 смесью безводный этанол — безводный диэтиловый эфир (1:3) до кристаллического

Г 1

55 состояния, отделяют центрифугированием, промывают 2 раза 2 мл холодной воды для удаления гримеси исходного аденозина, повторно центрифугируют, затирают с указанной смесью, после чего целевой продукт очищают переосажден;,ем из безводного этанола безводным эфиром или тонкослойной хроматографией на силикагеле в системе растворителей: н-бутанол — вода (85:15 по объему), Получают 120 мл (27,5%) целевого продукта.

Пример ы 2 и 3 . 5 -(-Гидрокси-4(фторсульфонил)бензоил)аденозин.

Процесс проводят в условиях примера

1, Значение параметров процесса и выходы целевого продукта представлены втаблице1, Пример 4. 5 -(2-Гидрокси-4-(иодацетамида)бензоил)аденозин.

В условиях примера 1 из 898 r (2,8 ммол ь) 2-гидрокси4-(иодацетамидо)бензойной кислоты получают 750 мг целевого продукта (выход 47%).

Пример 5 . 5 -(2-Гидрокси-4(2,5-дигидро-2,5-диоксопи ррол ил-1)бен зоил)аден-: озин.

В условиях примера 1 из 654 мг (2,8 ммоль) 2-гидрокси-4-(2,5-дигидро — 2.5-диокоопирролил-1)бензойной кислоты получают

162 мг целевого продукта (выход 12%).

Пример 6, 5 -(2-Гидрокси-5-(фторсульфонил)бензоил)гуанозин.

В условиях примера 1 из 293 г (0,933 ммоль) гидрохлорида гуанозина получают.

175 мг целевого продукта (выход 13%).

Пример 7 .5 -(2-Гидрокси-5-(фторсульфонил) бензоил)гуяноэин.

Б условиях примера 1 из 224 мг (0,7 ммоль) гидрохлорида гуанозина получают

51 мг целевого продукта (выход 15%).

Пример 8 . 5 -(2-Гидрокси-4-(иодацетамидо)бензоил)гуанозин.

В условиях примера 1 из 1250 мг (3,5 м мол ь) 2-гидро кси-4-(и ода цетямидо) бе нзойной кислоты и 320 мч (1 ммоль} гидрохло166 В 7

10

25 рида гуаноэина получают 198 мг целевого продукта (выход 41%).

Физико-химические характеристики полученных соединений представлены в табл.2.

Пример 9 (сравнительный )

В условиях примера 1 обрабатывают

815 мг (3,5 ммоль) 2-гидрокси -4-(2,5-дигидро-2,5-диоксопирролил-1) бензойной кислоты указанным количеством тионилхлорида и остаток после соответствующих операций вводят ао взаимодействие с 320 мг (1 ммол ь) гидрохлорида гуанозина. Остаток после описанной обработки не содержит 5 2-гидрокси -4-(2,5-дигидро-2,5-диоксопи рролил1)бензоил)гуанозина.

Пример 10 (сравнительный )

В условиях примера 1 вводят во взаимодействие 2-гидрокси-5-(фторсульфонил)бензойную кислоту и тионилхлорид.

Остаток (0,5 мл) после упаривания реакционной смеси обрабатывают гексаном, выпавший осадок отделяют центрифугированием и высушивают при пониженном давлении в присутствии фосфорного ангидрида.

Далее процесс ведут в условиях примера 1. Анализ продукта, полученного после соответствующей обработки реакционной смеси, показывает наличие целевого продукта в следовых количествах.

При уменьшении молярного соотношения кислота — тионилхлорид (например, 1;1) и молярного соотношения кислота — нуклеозид(например, 1,7:1 для аденозина и 2,5:1 для гидрохлорида гуаноэина) наблюдается снижение выхода целевого продукта.

Необратимое ингибирование аденилатциклазы (КФ.4.6,1,1„АТФ-пирофосфатлиаза циклиэу.ощая) соединением, полученным в примере 1, изучают на аденилатциклазе плэзматических мембран хвостатого ядра мозга быка, выделенных по известной методике. Активность фермента определяют радЬоиэотопным методом по накоплению

32

P-цАМФ из сг Р-АТФ в процессе реакции, катализируемой аденилатциклазой. В состав реакционной смеси вводят: 50 мМ трис-НО(рН78(;20мМ MgCI2,2мМ цАМФ;

0,5 мМ ЭГТА; 2 мМ изобутилметилксантин;

10 мМ креатинфосфэт, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназэ; 0,1мМ АТФ; и аэ р-АТФ (500000 имп/мин).

Реакцию начинают внесением в инкубационную смесь, термостатируют при 37 С, суспензии мембран с содержанием белка

20-30 мг и проводят в течение б мин, Опре% еление количества образовавшегося р цАМФ осуществляют по известной методике.

Ингибировэние аденилатциклазной активности проводят в стандартных условиях при 23"С в 25 мМ натрий-боратном буфере (рН 8.0), содержащем фермент, описываемый ингибитор (2 мМ), 10 мМ MgCI2, 0,2 M сахарозу. Исследуемое соединение И перед внесением в преинкубационную смесь растворя ют в диметилсул ьфоксиде (ДМ СО). Конечная концентрация ДМСО в среде преинкубации составляет 20% как в пробах, содержащих предлагаемое соединение, так и в контрольных. Через определенные промежутки времени из преинкубационной смеси отбирают аликвоты, центрифугируют при 8000 g в течение 3 мин, осадок мембран разводят в двух объемах аликвоты раствором, содержащим 25 мМ Na-борат (рН 8,0);

0,2 M сэхарозу: 20% ДСМО. Суспензию мембран центрифугируют при 8000 g в.течение 3 мин и к осадку добавляют раствор в

1/2 объема аликвоты, содержащий 25 мМ

Na-6opa, рН 8,0; 0,2 М сахароэу. Полученные мембраны используют для определения активности аденилатциклаэы.

Эффект ингибирования аденилатциклазы предлагаемым соединением (Ц увеличивается с течением времени и не уменьшается после удаления соединения из среды преинкубэции, что указывает нэ необратимое связывание ингибитора с ферментом. При его совместной преинкубации с АТФ (2мМ), который является субстратом аденилатциклазы, наблюдают защитный эффект от действия ингибитора, что указывает на специфическое взаимодействие предлагаемых соединений с активным центром фермента. Ингибирование аденилатциклазы под действием соединения (I) охарактеризовано константой, которую рассчитывают известным способом (табл,3).

Значение Кках для соединения (I), а также для известного соединения определяют при их концентрации, равной 2мМ. Как вытекает из сравнения приведенных констант ингибирования, соединение (I) по своему ингибирующему действию, характеризующемуся возрастающим значением величины Краж, превосходит известное соединение.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет достаточно просто получать новые реакционноспособные замещенные 5 (2-гидроксибензоил)производные

1668367

Таблица 1

20 т аппп 2

%3

УФ-спектр (pH 7) Спактре О блуореткгенпгоь (рн 7) т.пл.,С Нт (S(lufol) . (с рака. плк системме

ttKспектр (ННт)0, смт ментяый анализ, 2

Спели- Бруттто-фар пение

6 ° 10t М( см

А В прнмеP!

Лиане (яоеб ) ° (6n7op. ), Выена — Найделено но

Зычна- Наодеяа на!

210,1410 297 (7501):

1730 (С О) 43,50 43„,18 3,44 3,59 !4,92 14,70 165 166 0,75

398

0,56 220 23,5 пп.250 20,6 ол.297 4,7

С1у Н ь УНРьБ

1684 325 (амяп. 1, С О)

1560/его!к 11)

1717 (С О) 300 о

40,42 3 36 \ 57 !4 76 !4,49 177-t79

0,49 272 22,1 пп.)05 !4,2

2 С Н, 08ьОг

375

52,29 51,94 3,76 3,71 17,42 17,62 210-212 0,49 0,31

255 !5,7 пп.310 Ь, 5

220 15,0 пл.240 12,2

an.275 7,Ü

275 28,6 пн.305 lt,5

Сг! "11 Наба

С, Нть У ну 03 Б

42,О7 42,33 3 32 3 47 14 43 t4 29 179 0 76 0 56

29&

386

t210,14l0 (УВОД !

680 (С 5)

1684 (nana.1, СО)

1 558 (агогп, II) 310

38,92 39,09 3,27 3,36 14,33 14,08 185 0,60 0,5!

С, Н, бпьое

«Система Лт я-бутаяол — уксусяаа кяслота — капа, 5:2:3 па актему. Система Б: ябутаноп кода, 85г15 ео обеему. не I уеспектрм и пектры блуореспенпкн сннмамт е 201-ном яапнач акаоксапе (рН 7) .

Таблица 3

К)(зж. 10", мин

Сое инение

150

8 пуриновых нуклеозидов, обладающие флуоресцентными свойствами.

Формула изобретения

Способ получения замещенных 5 -(2гидроксибензоил)производных пуриновых нуклеозидов общей формулы

R !г

В () с-о- о- (!)

© ОН OH где В-6-аминопуринил-9;

R< — водород;

Й2 — фто рсул ьфо груп па;

R<-иодацетамидогруппа или 2,5-дигидро-2,5-диоксопирролил-1 и R2 — водород (или В-2-амино-1,6-дигидро-2-оксопуринил-9;

R< — водород;

5 — (3 — (фторсульфонил ) бензоил) — аденозин известное сое инение

R2 — фторсульфогруппа, R> — иодацета.мидогрупа и Й2 — водород, о т л и ч а ющ и й. с я тем, что, соответствующую замещенную 2-гидроксибензойную кислоту BBQ5 дят во взаимодействие с тионилхлоридом при молярном соотношении реагентов, равном 1:(1,5-3), соответственно в среде, безводного диоксана или тетрагидрофурана, после чего реакционную смесь после

10 удаления избытка тионилхлорида непосредственно вводят во взаимодействие с раство ром аденозина или гидрохлорида гуанозина в безводном гексаметилтриамиде фосфорной кислоты при молярном соотношении ре15 агентов: исходная кислота — нуклеозид, . равном (2-3):1 в случае аденозина и (3-4):1 в случае гидрохлорида гуанозина.