Способ определения @ -экзотоксина

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения количества β экзотоксина в энтомопатогенных препаратах. Целью изобретения является упрощение способа и повышение достоверности результатов определения β - экзотоксина. В суспензию препарата, содержащего β - экзотоксин, или в культуральную жидкость вносят трилон Б, затем центрифугируют полученный супернатант, наносят полосой на пластинку силуфола УФ<SB POS="POST">254</SB>, хроматографируют в системе пропанол - аммиак - вода, элюируют β - экзотоксин с хроматограммы, фильтруют элюат через мембранный фильтр для удаления частиц силуфола, определяют оптическую плотность отфильтрованного элюата при длинах волн 260, 230 нм, вычисляют концентрации β - экзотоксина по формуле C<SB POS="POST">эт</SB> (мас.%) = 6D<SB POS="POST">260</SB> - D<SB POS="POST">230</SB> / 5,75 <SP POS="POST">.</SP> V<SB POS="POST">0</SB> <SP POS="POST">.</SP> V<SB POS="POST">2</SB> / M<SB POS="POST">0</SB> <SP POS="POST">.</SP> V<SB POS="POST">1</SB> <SP POS="POST">.</SP> 16,6, где V<SB POS="POST">0</SB> - объем мл, в котором суспендируют навеску препарата

M<SB POS="POST">0</SB> - навеска препарата (мг), V<SB POS="POST">1</SB> - объем раствора, наносимого на хроматограмму

V<SB POS="POST">2</SB> - объем раствора, используемого для спектрофотометрирования. В случае исследования культуральной жидкости V<SB POS="POST">0</SB> и M<SB POS="POST">0</SB> = 1, V<SB POS="POST">1</SB> - объем культуральной жидкости, наносимой на хроматограмму. Отклонение от средней величины не превышает 2 - 3%. 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4493668/13 (22) 13.10.88 (46) 23.08.91, Бюл. N31 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) В.В.Кувичкин, Ф.Ш,Исангалини и Т,М.Вирясова (53) 632,937.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 1359744, кл. G 01 N 33/50, 1987. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Р -ЭКЗОТОКСИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения количества /3 -экзотоксина в энтомопатогенных препаратах. Целью изобретения является упрощение способа и повышение достоверности результатов определения Р -экзотоксина. В суспензию препарата. содержащего Р -экзотоксин, или в культуральную жидкость трилон Б, затем

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения количества экзотоксина в энтомопатогенных препаратах.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение достоверности результатов определения экзотоксина.

Способ определения P экзотоксина заключается в следующем.

Используемый энтомопатогенный препарат растворяют в насыщенном водном растворе трилона Б. Суспензию центрифугируют, удаляют нерастворившиеся вещества, j3 -экзотоксин, содержащийся в супернатанте, очищают методом тонкослой5U 1672365 А1 (я)з 6 01 N 33/50, С 12 Q 1/00, А 01 N 63/00 центрифугируют полученный супернатант, наносят полосой на пластинку силуфола

УФ2 д, хроматографируют в системе пропанол — аммиак — вода, элюируют /3-экэотоксин с хроматограммы, фильтруют элюат через мембранный фильтр для удаления частиц силуфола, определяют оптическую плотность отфильтрованного элюата при длинах волн 260 и 230 нм, вычисляют концентрации Р -экзотоксина по формуле

6 0260 0230 Vp Ч2

Сэт = — — — - —, мас., 5,75 воЧ1 16,6 где Vp — обьем мл, в котором суспендируют навеску препарата; mp — навеска препарата (мг); Vi — обьем раствора, наносимого на хроматограмму; Ч2 — объем раствора, используемого для спектрометрирования. В случае исследования культуральной жидкости Vp u mp = 1 V> — объем культуральной жидкости, наносимой на хроматограмму.

Отклонение от средней величины не превышает 2 — 3 . 5 табл. ной хроматографии, полученный после хромотографии элюат фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,1 — 0,2 мкм, измеряют оптическую плотность фильтрата при длинах волн 260 и 230 нм и определяют количество -экзотоксина и и значении коз

j3 P ффициента расчетным путем по формуле

6 0260 — 0230 Vp V2

5.75 п)о V! 16 6 где Чо — объем, в котором суспендируют навеску препарата,мл;

m — навеска препарата,мг;

Ч1 — обьем раствора, наносимого на хроматограмму, мл;

1672365

Чг — объем раствора, используемого для спектрофотометрирования, мл, для определения С, (мгlмл) в культуральной жидкости в формуле полагают п1, = V„= 1.

16,6 — поглощение чистогоP экзотоксина при концентрации 1 мгlмл;

Ого, Огзо — поглощение элюата при соответствующих длинах волн.

Добавление трилона Б (динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты) крайне важно для препаратов, которые получены на питательных средах, содержащих ион ы двух валентн ых металлов (хлористый кальций, хлористый или серно-кислый магний и др), Экзотоксин обладает способностью образовывать слаборастворимые комплексы с ионами двухвалентных металлов и поэтому при наличии в питательной среде двухвалентных ионов частью-экзотоксина связана и не отделяется при выделении традиционными методами. Это приводит к заметно заниженым результатам определения

P -ýêçoToêñèíà как в препарате, так и в культуральной жидкости, Например, в препаратах, полученных на поликомпонентной среде, содержащей 0,2 СаС!г, 20 — 25 (, Р-экэотоксина в связанном состоянии, а на ацетатной среде, содержащей 3 — 4ф, ацетата кальция, связано 60 — 70 j3-экзотоксина, Добавление избытка трилона Б, который связывает двухвалентные ионы, приводит к освобождению и растворению

Р -экзотоксина.

В табл.1 показаны результаты исследований на примере чистого (чистота 99,5 )

/3 -экзотоксина.

Пример 1. К 2 мл водного раствора

Р -экэотоксина в концентрации 6 мл/мл (0,6 ) добавляют 20 мкл 57ь-ного водного раствора СаОг. Для ускорения процесса осаждения добавляют несколько капель

25 -ного водного раствора аммиака, доводя рН до 8,0 (об осаждении судят по помутнению раствора). К2 мл суспензии, содержащей нерастворимый комплекс

Р -экзотоксина с кальцием, а также свободный экзотоксин, добавляют 6 мл насыщенного раствора трилона Б или 6 мл дистиллированной воды (контроль) и фильтруют через фильтр "Владипор" М 1 или М 2(размер пор

0,1 — 0,2 мкм). То же делают при отсутствии хлористого кальция. В фильтратах определяют значение оптической плотности при длине волны 260 нм.

Как следует из табл,1, добавление трилона Б не сказывается на поглощении P-экзотоксина. При добавлении СаС!г примерно

33$ P -экэотоксина осаждается, что приводит к снижению оптической плотности. При добавлении же 1рилона Б результат практически совпадает с величинами, полученными при растворении чистого P экэотоксина в воде.

При хроматографии 100 мкл образца наносят "полосой" на пластину силуфола

УФг 4 размером 20 х 20 мп. Количество

Р-экзотоксина, наносимого на пластинку, должно быть таковым, чтобы после элюации обеспечивать поглощение выше порога чувствительности используемого спектрофотометра.

Фильтрование элюата проводят с целью удаления частиц силикагеля, вызывающих светорассеяние образцов, отражающееся на точности определения оптической плотности. Концентрацию j3-экэотоксина в препарате определяют по формуле, где первый сомножитель (в скобках) дает истинное поглощение Р-экэотоксина, вычитая вклад примесей, присутствующих в препаратах:

5

6 Огю — Огзо Ч1 Чг

5,75 п)о Ч 16,6

= 0,84/60ж — Огзо, мас. 7ь, где Vo — объем раствора трилона 6. в котором суспендируют навеску препарата, мл, m< — навеска препарата, мг;

Vl — объем раствора, наносимого на хроматограмму, мл;

Чг — обьем спектрофотометрируемого раствора, мл;

16,6 — поглощение чистогоф -экзотоксина при концентрации 1 мг/мл при 260 нм.

Для определения С», мг/мл, в культуральной жидкости m< - Ч - 1.

Определение точности метода производится по контрольным опытам с применением высокоочищенного Р -экэотоксина (чистота 96 — 987ь). Затем составляют пробы с заранее известным содержанием Р-экзотоксина (в качестве наполнитепя, в частности, используют препарат лепидоцид, не содержащий Р -экэотоксина).

Результаты представлены в табл.2.

Статистический анализ приведенных зависимостей показал, что точность предлагаемого метода выше. чем Зф,, Пример 2. Исследуемый препарат (0,5 г) суспендируют в 8 мл насыщенного водного раствора трилона б. Суспенэию центрифугируют при 8000 об/мин в течение

10 мин, Супернатант (100 мкл) микрошприцом наносят полосой на пластину силуфолв

УФгу 20 х 20, с края наносят свидетель— чистый Р-экзотоксин. Пластину хроматогра1672365

Таблица 1

Таблица 2 фируют в системе пропанол 25ф, — аммиак — вода (10:2;5). Положение разделенного вещества определяют в УФ-свете. Адсорбент переносят в бюкс для элюирования с помощью 5 мл 0,01 M раствора аммиака. элюат фильтруют через мембранный фильтр

"Владипор" (0,1 — 0,2 мкм) для удаления частиц силуфола и измеряют оптическую плотность при длинах волн 260 и230 нм.

Кон центра ци ю j3 --з кзотоксина определяют по укаэанной формуле, Результаты представлены в табл.3 и 4.

Пример 3, 8 культуральную жидкость (5мл), содержащую Р -экзотоксин, добавляют 20 мг трилона Б, центрифугируют при

8000 об/мин в течение 5 мин, 100 мкл супернатанта наносят полосой на пластину (20 х 20) силуфола УФг 4. Далее по примеру

2. Концентрацию /3-экзотоксина определяют по формуле приведенной в примере 1, полагая mo = Н = 1.

Результаты и редста влен ы в табл.5.

Предлагаемый способ прост, имеет чувствительность, позволяющую определять концентрацию Р -экзотоксина во всех промышленных препаратах и в культуральной жидкости на разных стадиях производства препаратов, а также при их хранении. Способ не требует дефицитного оборудования и реактивов, анализ может быть проведен в течение 30 мин, что позволяет его отнести к экспресс-методам. Способ может быть полезен в научно-исследовательских и заводских лабораториях как альтернатива длительным биоиспытаниям и используемым полуколичественным методам onределения)3-экэотоксина, Формула изобретения

Способ определения /3-экзотоксина. предусматривающий удаление нераство5 римых веществ из исследуемого образца с последующей очисткой /3 -зкзотоксина методом гонкослойной хроматографии, измерением оптической плотности полученного элюата и определением количества экзоток10 сина расчетным путем, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа и повышения достоверности, перед удалением нерастворимых вещесгв в исследуемый образец вносят трилон Б. перед измерени15 ем оптическои плотности элюат фильтруют на мембранных ультрафильтрах с размером пор 0,1 — 0,2 мкм. а количество С» экзотоксина рассчитывают по формуле

6 D25Q — D$3o Vo Нг

5,75 п)о Н1 16,6

25 где Dye u 02зо — поглощение элюата при соответствующих дл и н ах вол н;

Vo — объем, в котором суспендируют навеску препарата, мл;

mo — навеска препарата, мг;

Н вЂ” объем раствора, наносимого на хроматограмму, мл;

Нг — объем раствора, используемогодля спектрофотометрирования, мл, для определения С», мгlмл, в культураль35 ной жидкости в формуле полагают mo Vo =

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Составитель И.Залунин

Редактор А.Козориз Техред М.Моргентал Корректор Т.Колб

Заказ 2836 Тираж 394 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101