Способ количественного определения содержания двуспиральных рнк

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и аналитической химии. Целью изобретения является упрощение способа и повышение его точности. Пробу растворяют в буферном растворе, содержащем 0,05 М ацетата Na, рН 4,6, 0,05 М NaCI, 0,001 М ZnS04 (буфер А), и измеряют оптическую плотность раствора. Затем раствор нагревают до 45°С, добавляют Si-нуклеазу в количестве 95-115 ед. акт. на 1 о,е, нуклеотидного материала и проводят реакцию гидролиза в течение 25-35 мин. Содержание дс РНК определяют по формуле, приведенной в тексте описания изобретения. Точность анализа составляет 8% отн., длительность анализа - не более 2 ч. 1 ил,

„„Я3 „„1677040 А1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 07 Н 21/02, С 12 Р 19/24, 6 01 и 33/52

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

-.,,, У;)ЯР.

1!ы.,. . -7 .=-МИ..- .! .О" .jg 1 -- Г А

К AQTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4650623/13 (22) 13.02,89 (46) 15.09,91, Бюл. hh 34 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) О.А.Беличенко, С.Н.Загребельный, Т.И,Котюшева, Е,Ю.Крынецкий, Б.С.Прохоров и В.И.Пупкова (53) 547.963,3 (088.8) (56) J, Mol, Biol., 1966, 17, М 1, р. 145-173. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДВУСПИРАЛЬНЫХ РНК

Изобретение относится к молекулярной биологии и аналитической химии, а именно к способам количественного определения двуспиральных PHK (дс PHK).

Целью изобретения является упрощение способа и повышение его точности.

Упрощение способа и повышение точности достигается за счет следующих приемов, одноцепочечные PHK (gc РНК) в анализируемом образце гидролизуют ферментом S>-нуклеазой (95-115 ед. акт. на 1 о,е, нуклеотидного материала в течение 2535 мин), количество дс РНК определяют по разности между исходной оптической плотностью и оптической плотностью определяющей вклад оц РНК.

На чертеже показана кинетика гидролиэа одно- и двуцепочечных РНК в зависимости от активности фермента S1-нуклеазы и времени гидролиэа, (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и аналитической химии. Целью изобретения является упрощение способа и повышение его точности. Пробу растворяют в буферном растворе, содержащем 0,05 M ацетата Na, рН 4,6, 0,05 M NaCI, 0,001 M

ZnSO4 (буфер А), и измеряют оптическую плотность раствора. Затем раствор нагревают до 45 С, добавляют S1-нукл вазу в количестве 95 — 115 ед. акт. на 1 о,е, нуклеотидного материала и проводят реакцию .гидролиза в течение 25 — 35 мин. Содержание дс РНК определяют по формуле, приведенной в тексте описания изобретения.

Точность анализа составляет 8% отн„длительность анализа — не более 2 ч. 1 ил.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Анализируемую пробу растворяют в буферном растворе, содержащем 0,05 м ацетатэ натрия рН 4,6, 0,05 м NaCI, 0,001 м

ZnSO4 (буфер А), и замеряют оптическую плотность раствора, Далее раствор нагреваютдо45 С, добавляют фермент S1-нуклеазу в количестве 95-115 е.а. на 1 о,е. нуклеотидного материала и проводят реакцию гидролиза при данной температуре в течение

25 — 35 мин. Содержание дс РКН в нуклеотидном материале анализируемого образца определяют по формуле

X= (Ao — — -- --" ) 100 . (1)

К где Х вЂ” содержание дс РНК, %;

A0 — оптическая плотность раствора, взятого на анализ;

А1 — оптическая плотность раствора после проведения реакции гидролиэа;

1677040

К вЂ” стандартная величича коэффициента гиперхромного эффекта одноцепочечной

РНК, равная 0,420, Точность анализа составляет 87 отн.

Длительность анализа составляет не более 2 ч.

Пример 1. На анализ берут препараты дс РНК фага о 6, имеющие следующий состав: 10-90 дс РНК, 10-907ь одноцепачечной РНК.

Из приготовленного раствора препарата дс РНК (1 мг в 4 мг в 4 мл буфера А) отбирают 2 аликвоты по 1 о.е.; в одной из них замеряют точную оптическую плотность раствора при длине волны 260 нм. Оптическая плотность Ao = 0,981, Другую аликвоту нагревают до 45 С, к ней добавляют 100 ед. акт. фермента S1-нуклеазы и проводят реакцию гидролиза при данной температуре в течение 30 мин. По истечении времени гидролиза определяют оптическую плотность гидролиза при длине волны 260 нм.

Оптическая плотность А1 = 1,270, Содержание дс РНК (х) в нуклеотидном материале исследуемого образца вычисляют па формуле (1); оно составляет 29,3 Д.

Пример 2. Проведение анализа аналогично приведенному в примере 1 за исключением того, что время гидролиза составляет 25 мин, а количество добавленного фермента — 95 ед, акт, на 1 о.е. нуклеатидного материала.

Оптическая плотность исходного раствора Р Ао = 1,047;

Оптическая плотность гидролизата

А1 = 1,370.

Содержание дс P HK в нукл еотидном глатериале составляет 27,0;4, Точность определения 87 отн.

Пример 3. Проведение анализа аналогично приведенному в примере 1 эа исключением гога, что время гидрализа составляет 35 мин, а количество добавленного фермента — 115 ед, акт. на 1 о.е. нуклеотиднага материала, Оптическая плотность исходного раствора Аа =- 1,142.

Оптическая плотность гидролизата

А1 =- 1,483.

Садержаниедс РНКв нуклеотидномматериале составляет 35,1.

Точность определения 87, отн.

Пример 4, Проведение анализа аналагич» о приведенному в примере 1 за исключением того, что время гидролиэа составляет 20 мин,а количество добавленногоо фермента — 100 ед, акт, на 1 о,е. нуклеотиднога материала, Оптическая плотность исходного раствора Ао = 1 040, Оптическая плотность гидролизата

А1 = 1,330.

5 Содержание дс РНК в нуклеотидном материале составляет 35ф, В этом случае результат получен неправильный, так как не полностью прошел гидролиз одноцепочечной РНК, чта привело к

10 получению завышенного результата.

Пример 5. Проведение анализа аналогично приведенному в примере 1 за исключением того, что время гидролиза составляет 30 мин. Количество добавленно15 го фермента 200 ед. акт. на 1 о,е. нуклеотидного материала, Оптическая плотность исходного раствора Ао = 1,030.

Оптическая плотность гидролизата

20 А1 = 1,365, Содержание дс РНК в нуклеотидном материале составляет 23 (,, В данном случае результат получен неправильный, так как частично прошел гид25 ролиз дс РНК, что привело к занижению результата.

Использование предлагаемого метода обеспечивает сокращение времени анализа с 5 до 2 ч за счет уменьшения числа стадий

30 и времени гидролиза, Кроме-того, данный метод позвоЛяет повысить точность определения, т.к. исключается ряд стадий (фильтрация, осаждение), на которых возможны потери материала, 35 Применение изобретения в лабораторных работах и на производствах, связанных с получением высокоэффективных средств борьбы с вирусными инфекциями, повысит их эффективность и экономичность.

Формула изобретения

Способ количественного определения содержания двуспиральных РНК, включающий растворение анализируемого образца

45 в буферном растворе с последующим спектрофатометрическим измерением оптической плотности образца, гидролизом одноцепочечных PHК ферментом, о тл и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения

50 способа и повышения его точности, гидролиз одноцепочечных РНК проводят ферментом S>-нуклеазой в течение 25-35 мин при соотношении фермент:нуклеотидный материал 95 — 115 ед, акт,:1 о.е., определяют on55 тическую плотность гидрализата и определяют количество двуспиральных PHK па разности между оптическими плотностями исходного образца и гидрализата.

1677040

15 Я Ф5 60

75 УО Й 5 1Л7 Г /

Время гцдролиза

Редактор M. Циткина

Заказ 3082 Тираж М Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

М

g ф5 40

1 с 35 30

>+ 15

Составитель Н. Александрушкина

Техред М.Моргентал Корректор М.Иароши