Штамм бактерий рнотовастеriuм рноsрноrеuм - продуцент l - аргининдекарбоксилазы

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к получению нового штамма, обладающего высокой L- аргининдекарбоксилазной активностью. Цель изобретения - выявление более активного штамма Photobacterium phosphoreum - продуцента индуцибельной L-аргининдекарбоксилазы. Штамм Ph. phosphoreun (189) BK1IB-1716D был выделен из морской воды в Филиппинском море и было выявлено новое семейство - высокая активность L-аогининдекарбоксилазы (3,23-5,23 ед./мг сухой бактериальной массы и 25,33-29s60 ед./мг белка). Штамм сохраняет активность при хранении его под вазелиновым маслом и в лиофилизировааном состоянии. 2 табл. §

СОЮЗ С08ЕТСНИХ

ССЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕа)УБЛИН (19) (И) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4740366/13 (22) 25.09.89 (46) 23.09,91. Бюл. Р 35 (71) Вильнюсский государственный университет им. В.Капсукаса и Институт биофизики СО AH СССР

{72) А.В.Рузгене, А.Б.Рагавичюс, П,А.Брузгулис, A.М.Фиш и Г.А.Примакова (53) 577.15 (088.8)

{56) Килюс В.И. Аргининдекарбоксилазная активность бактерий рода Citrobacter. Достижения микробиологии— практике. — Тезисы VII съезда Всесоюзного микробиологического обшества.

1985, т. 2, с. 71.

Blethen S., Backer Е. and Shell Е.Е.

Arpinine decarboxydase from Escherichia cali J. — Biol. Chem, 1968, 243, )) 8, р. 1671-1677.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий, продуцирующий индуцибельную L-арнининдекарбоксилазу (Арг Д/К) .

Цель изобретения — выявление более активного штамма Photobacterium

phosphor ium — продуцента индуцибельной L-ap гининдекарбоксилазы.

Штамм является строгим галофилом (не растет без NaC1), для получения ферментного зкстракта клетки разрушают осмотическим шоком.

Штамм Photobacterium phosphoreum

189 выделен из морской воды.в Филип-, С 12 Н 9/88, 1/20

{51) 5

2 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ РНОТОВАСТЕКПЗМ

PHOSPHOREUH-ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНДЕКАР БОКСИЛАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению нового штамма, обладающего высокой Lаргининдекарбоксилазной активностью.

Цель изобретения — выявление более активного штамма Photobacterium phosphoreum — продуцента индуцибельной

L-аргининдекарбоксилазы. Штамм Ph.

phosphoreum (189) ВКМВ-17160 был выделен из морской воды в Филиппинском море и было-выявлено новое семействовысокая активность L-аргининдекарбоксилазы .(3,?3-5,23 ед./мг сухой бакте- а риальной массы,и 25.,33-29,60 ед./мг белка). Штаьм сохраняет активность при хранении его под назелиновым маслом и в лиофилизировапном состоянии.

2 табл. пинском море в лаборатории фотобиологии Института биофизик - CO AH СССР г; Красноярска. Штамм хранится во

Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКМ В1716Д.

Морфологические признаки. Короткие палочки размером 0,8-1,3х1,8-2,4 мкм.

Граммотрицательны, капсул не образуют. Подвижны благодаря одному или пучку -(1-3) неочехленных полярных жгутиков.Культуральные свойства. Рост бактерий Photobacterium phosphoreum 189 на различных агаризованных средах

1678834 . при 30 С после 24 ч культивирования представлен в табл. 1.

На всех агаризованных питательных средах колонии круглые, желтовато-ко- 5 ричневые, прозрачные, блестящие с правильными краями.

Физиологические свойства. Штамм является факультативным анаэробом.

Оптимальная температура для роста и 10 свечения 20-30 С. Растут при 4 С и не растут при 35 0. Растут при рН среды

6,0-9,0. Восстанавливает нитраты до нитритов. Индол и сероводород не выделяют. Не выделяют амилазу, липазу, 15 желатиназу.Растет на синтетической среде, содержащей в основе морскую воду, глюкозу и ИН4С1.

Усваивает глюкозу, маннозу, фрук- 20 тозу, мальтозу, галактозу, глицерин.

Усваивает пептон, дрожжевой экстракт, а также соли аммония. Хемоорганотроф.

Для роста и люминесценции необходимо присутствие в среде ионов натрия. On- 25 тимальная концентрация хлористого натрия 2,5-3,0 . Обладает люминесценцией в сине-зепеной области спектра.

Признаки штамма устойчивы.

Музейная культура хранится в пробирках на полужидкой агаризованной среде Егоровой нод вазелиновым маслом. Она хорошо сохраняется в течение г,. а при длительном хранении следует пересевать. 35, Пример 1. Для оживления музейной культуры Photobacterium phosphoreum 189 бактерии пересевают на питательный агар (ПА) с З . NaC1 в чашки Петри и инкубируют 24 ч в тер - 40 мостате при 30 С. Оживленную культуру пересевают в пробирки на косяки ПА с

3% NaC1 и инкубируют 24 ч при 30 С.

Для получения инокулята применяют среду Р 1. Данную среду разливают по 45

100 мл в конические колбы емкостью

250 мл. Среду стерилизуют 30 мин при

0,5 атм.. Простерилизованную среду засевают суспензией клеток в количестве

5 мл (по объему). Культуру выращивают 50

12 ч. при 30 С при слабой аэрации (100 об./мин).

Для получения биомассы Ph.phosphoreum 189 штамм выращивают на традиционной полусинтетической для данного вида среде (K - 1, дополнительно добавляя L-аргинин НС1„ как индуктор), г/л:

NaCl 30,0, MgSOg ° 7H O 0,2, KHpPOq

1,0; Иа НРО 6,0 (NH4) HPOy 0,5; глицерин 3 мл, пептон 10,0, L-аргинин НС1

1,5, дистиллированная вода до 1 л рН 6,4Ю,05, Питательную среду разливают по

200 мл в качалочные колбы емкостью

500 мл и стерилизуют 30 мин при

0,5 атм. Стерильную питательную сре.ду засевают инокулятом — культурой

Ph.phosphoreum 189 в количестве .10 (по объему). Выращивание продуцента в колбах проводят. на качалке (100 об./мин) согласно известным условиям (начальной рН среды 6,4, температура культивирования 30 С, продолжительность роста 12 ч).

Биомассу бактерий отделяют центрифугированием на центрифуге ЦЛС-3 при 4000 об./мин в течение 10 мин, Биомассу промывают 3%-ным NaC1 и для экстракции фермента заливают 20 мл

0,2 М ацетатного буфера с рН 5,2, охлажпенного до 4 С, с добавлением

5 10 М пиридоксальфосфата и 10 3 M

ЕДТА. В экстракте определяли L-аргининдекарбоксилазную активность манометрическим методом в аппарате Варбурга.

За единицу Арг Д/K активности принимали такое количество фермента, который при температуре 37 С и рН реакционной смеси 5,2 через 1 мин от субстрата (0,025 М ? -аргинина НС1) от щепляют 1 мкмоль СО . Арг Д/К активность выражали единицами в пересчете

1 на 1 мг сухих клеток и в мг белка (специфическая активность). Белок оп ределяли методом Бредфорда.

Пример 2. Для получения биомассы культуру Ph.phosphoreum 189 выращивают на традиционной среде К- 2 данного вида, дополнительно добавляя как индуктор L-аргинин НС1, г/л: NaC1

30,0, КН РО4 1,0, (ИНс ) НРО4 0,5;

MgS0p. 7НОО О, 1, глицерин 3 мл, пептон 10 0 дрожжевой экстракт 0,5

L-аргинин НС1 1,5, дистиллированная вода до 1 л", рН 6,4+0,05.

Способ приготовления среды, усло- вия культивирования продуцента, определение активности как и в примере 1. !

Пример 3. Для получения биомассы культуры Ph;phosphoreum 189 выращивают на традиционной среде данного рода следующего состава, дополнительно добавляя как индуктор L-аргинин НС1, г/л: пептон 10,0; NaC1 30,0, Мр$0ф ° 7ЙеО 0,5i КНеРОд 1,0, L-аргинин 1678834

Т аблица 1

Диаметр колонии мм

Среда

Агаризованная среда

Егоровой (пример 3) 1,0-1, 2

Питательный агар сухой (гидролизат кильки) +

+ ЗЖ NaC1

Агаризованная полусинтетическая Среда (пример 1) 1,0-1,2

Агаризованный мясо-пептонный бульон + ЗЖ NaC1

0 5-0,7

Таблица 2

Арг Д/К активность

Кол-во белка, мг/мл

Выход биомассы, мг/мл

Пример

Штамм на 1 мг белка (спецйфическая активность) на1мг сухих клеток

Escherichia co1i В, Изве- О, 40 О, 150 вест- .. ный

13,00

1,95

НС1 1,5, рыбная вытяжка 0,5 л, водопроводная вода до 1 л, рН 6,4+0,05, Способ приготовления питательной среды, условия культивирования проду-.5 цента, определение активности как и в примере

Предлагаемая культура на известной среде не росла, так как в ней отсутствует нужное количество NaC1. При 10 добавлении в известную среду 3Х хлористого натрия культура росла; но выход биомассы и L-аргининдекарбоксилазная активность ниже и составляет 2,56 ед./мг сухих клеток и 15

14,5 ед./мг белка.

В табл. 2 приведены данные об 1,— аргининдекарбоксилазной активности штамма ".РЬо оЬасйегшт phosphoreum

189 и известного Escherichia coli В.

Как видно из табл. 2, предлагаемый штамм Photobacterium phosphoreum 189 отличается от известного в 1,652,68 раза большей активность в 1 мг сухих клеток. Кроме того, выход биомассы на 37Х выше по сравнению с известным при тех ze условиях культиви«. рования, а специфическая активность в два и больше раза выше.

Данное преимущество может существенно уменьшить себестоимость ферментного препарата при его изготовлении. Ферментный препарат Ь-аргининдекарбоксилаза может быть использован при определении Ь-аргинина и при получении агматина из Ьаргинина путем его декарбоксилирования. Для получения определенного количества ферментного препарата уменьшается число ферментаций, что делает штамм выгодным для применения в промышленных условиях.

Формула изобретения

Штамм бактерий Photobacterium

phosphoreum BKNB-1 716D — продуцент

L-аргининдекарбоксилазы. !

1678834 Продолжение таблицы

Арг Д/К активность

Пример

Штамм

Photobaeterium phosphoreum 189 (ВКИ В-17160) 1 056 О, 109

29, 60

5,23 в е

° ф

Составитель И. Привалова

Техред C,Èèãóíoûà Корректор M,Ñàìáoðñêàÿ

Редактор Н.Яцола

Тираж

Заказ 4681

Подписное

ВНИИЛИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Выход биомассы, мг./мл

2 0,55

3, 0,55

Кол-во белка, мг /мл

0,136

О, 182 на 1 мг сухих клеток

3,2Ç

3,44 на 1 мг белка (специфическая ак тивность) 25,33

28,75