Рекомбинантная плазмидная днк pbanp 464, кодирующая металлопротеиназу bacillus amyloliquefaciens a-50 и штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens - продуцент металлопротеиназы.

 

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и микробиологической промышленности и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, синтез металлопротеиназы Bacillus amyloliquefaciens А-50 и штамм В, amyloliquefaciens A-50, содержащий эту рекомбинантную плазмиду, - продуцент металлопротеиназы. Цель изобретения: повышение уровня продукции секретируемой металлопротеиназой. Методами молекулярного клонирования создана плазмида pBANP 463, кодирующая металлопротеиназу B.amyloliquefaciens А-50, а также штамм - продуцент этого фермента. Штамм хорошо растет на промышленных культивационных средах и выделяет в культуральную жидкость значительные количества металлопротеиназы, в 2 раза большие, чем у имеющихся продуцентов. Штамм B. amyloliquefaciens А-50/pBANP 463 задепонирован в ВКПМ под номером B-4698. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, генетической инженерии и микробиологической промышленности и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую синтез металлопротеиназы Васillus amyloliquefaciens А-50, и штамм В. аmyloliquefaciens А-50, содержащий эту рекомбинантную плазмиду - продуцент металлопротеиназы. Металлопротеиназы представляют собой ферменты, расщепляющие белки. Их используют в пищевой и легкой промышленности, а также в сельском хозяйстве и медицине. Известны бациллярные штаммы - продуценты различных металлопротеиназ, созданные методами традиционной селекции, а также, например, В.аmyloliquefaciens А-50. Известен штамм Васillus subtilis, содержащий рекомбинантную плазмиду с геном металлопротеиназы В.amyloliquefaciens А-50. Однако, несмотря на относительно высокий уровень биосинтеза фермента в культуральной жидкости В. subtilis, использование такого штамма в промышленности затрудняется плохим ростом на промышленных средах. В настоящее время для промышленных целей используют производные штамма В.аmyloliquefaciens А-50 (ВКПМ В-340), основным недостатком которого является относительно низкая продуктивность (см.таблицу). Цель изобретения - повышение уровня продукции секретируемой металлопротеиназы В. аmyloliquefaciens А-50 в процессе ферментации в промышленных условиях. Сконструирована новая рекомбинантная плазмида рВАNP 463, которая кодирует синтез металлопротеиназы. В.аmyloliquefaciens А-50, имеет размер 6,3 т. п.н. и содержит: ВаmHI - фрагмент ДНК векторной плазмиды рВА 4 размером 4,4 т.п.н., где предварительно с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 удаляют участок узнавания ЕсоRI, расположенный в полилинкерной последовательности векторной плазмиды, Вgl II - Вс I - фрагмент ДНК плазмиды рNM1 размером 1,9 т.п.н., содержащий ген металлопротеиназы В.аmyloliquefaciens А-50, перечисленные фрагменты ДНК содержат следующие гены: npr-ген, кодирующий металлопротеиназу А-50, emr-ген, кодирующий устойчивость клеток к эритромицину; par-область, обеспечивающую стабильное наследование плазмиды. Создан штамм В.аmyloliquefaciens А-50 (рВАNP 463) - продуцент металлопротеиназы (регистрационный номер ВКПМ В-4698 во всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика), - секретирующий 12-13 ед. активности фермента на 1 мл культуральной жидкости. Активность определяли по описанию в работе Йомантаса и др. (Биотехнология, 1988, т. 4, 692). Штамм-продуцент получают путем введения рекомбинантной плазмиды рВАNP 463 в протопласты бесплазмидного штамма В.аmyloliquefaciens А-50 известным методом. Штамм В.аmyloliquefaciens ВКПМ В-4698 характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные размером 2,5-4,0х0,5-0,8 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие. Размер спор 1,0-1,2х0,6-0,7 мкм. Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном агаре, агаре Хоттингера - колонии шероховатые, круглые, маточные, желтовато-серые, край неровный, лопастной. При росте в жидких средах: мясопептонном бульоне, LB-бульоне без аэрации образуют сухую пленку без помутнения среды, а при аэрации образуют интенсивную муть. Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре от 20 до 45^оС при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности d - глюкозу, d - фруктозу, лактозу. Не усваивают ацетат, галактозу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Желатину разжижают. Индол не образуют. Уреазная активность не обнаруживается. Штамм проявляет устойчивость к эритромицину, обусловленную наличием плазмиды рВАNP 463. П р и м е р 1. Конструирование плазмиды рВАNP 463. Плазмидный вектор рВА 4 выделяют из штамма В.subtilis. Полученный препарат плазмиды рВА 4 используют для конструирования плазмиды рВА 46, в которой с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 удален один из двух участков узнавания эндонуклеазы рестрикции ЕсоRI. Конструирование проводят следующим образом. 5 мкг ДНК плазмиды рВА 4 инкубируют с эндонуклеазой ЕсоRI (0,5 ед. активности) в буфере А (100 mM трис-НСl, рН 7,5, 10 mM MgCl₂, 6 mM 2-β -меркаптоэтанола, 40 mM NaCl) в течение 20 мин при 37^оС, реакцию останавливают добавлением 2,5 объемов 96%-ного этанола. Образовавшийся осадок собирают центрифугированием (1200 об/мин, 10 мин, 4^оС) и растворяют в 20 мкл буфера ТЕ (10 mM трис-НСl, рН 8,0, 1mM ЭДТА), после чего вносят смесь дезокситрифосфатов до конечной концентрации 0,25 mМ каждого. Затем в реакционную смесь вносят 2 ед. Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы 1. Реакцию достройки липких концов проводят при комнатной температуре 30 мин в конечном объеме 30 мкл. Реакцию останавливают добавлением 2,5 объемов этанола. Образовавшийся осадок растворяют в 20 мкл буфера, содержащего 50 mМ трис-НСl, рН 7,5, 10 mM МgCl₂, 50 mM NaCl, 0,5 mM АТФ, и добавляют 20 ед. ДНК-лигазы фага Т4. Лигирование проводят при 14^оС в течение 4 ч. Полученной смесью трансформируют клетки В.subtilis SB 112. Трансформацию проводят следующим образом: ночную культуру клеток В.subtilis SB 112, выращенных в жидкой среде Спицайзена I (0,8% глюкозы, 0,04% казаминовых кислот, 0,1% дрожжевой экстракт, 50 мкг/мл L-триптофана, 50 мкг/мл L-фенилаланина, 1,83% К₂НРО₄ х 3Н₂О, 0,6% КН₂РО₄, 0,2% (NН₄)₂SО₄, 0,12% Na₃C₆H₅О₇ х 5,5Н₂О, 0,01% МgSО₄ х Н₂О, рН 7,0) разводят в 10 раз той же средой и растят 4,5 ч с аэрацией при 37^оС. Затем клетки разводят в 8 раз транформационной средой Спицайзена 11, отличающейся от среды I тем, что она не содержит аминокислот, дрожжевого экстракта, а содержание казаминокислот составляет 0,02% и МgSО₄ (0,07% ). Клетки в такой среде растят с аэрацией 1,5 ч, после чего используют для трансформации. Препарат ДНК инкубируют с компонентными клетками при 37^оС 2 ч и высевают на агаризованную среду LB с эритромицином (10 мкг/мл). Среди выросших на эритромицине клонов находят такие, где содержится плазмида с одним участком расщепления эндонуклеазой ЕсоRI. Одну из таких плазмид - рВА 46 - используют для конструктирования плазмиды рВАNP 46. Донором гена металлопротеиназы В. аmyloliquefaciens А-50 служит плазмида pNM 1. Препараты ДНК-плазмид рВА 46 и рNM 1 получают так же, как и препарат ДНК-плазмиды рВА 4. 5 мкг ДНК рВА 46 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции ВаmHI в стандартных условиях. ДНК-плазмиды рNM 1 гидролизуют эндонуклеазами Вgl II и Bcl I. Полученные фрагменты ДНК-плазмид рВА 46 и рNM 1 смешивают в соотношении 1:1 и сшивают ДНК-лигазой фага Т4 по методике, описанной выше. Полученной смесью трансформируют клетки В.subtilis Аj73 npr-аpr-amy. После высева на селективную среду, содержащую 1,5% агара, 30% обезжиренного молока и 10 мкг/мл эритромицина, отбирают клоны, устойчивые к эритромицину и гидролизующие казеин молока. Из отобранных таким образом клеток выделяют плазмидную ДНК, как описано выше, и обозначают ее рВАNP 463. Плазмида рВАNP 463 с одержит фрагмент ДНК В.аmyloliquefaciens А-50 с геном, ответственным за cинтез секретируемой металлопротеиназы. Анализ генетических маркеров в плазмидах проводят следующим образом. 1. Устойчивость клеток В.subtilis Аj73 npr-apr-amy, содержащих плазмиду рВАNP 463, анализируют на среде с содержанием эритромицина 5-20 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с такой концентрацией эритромицина. 2. Наличие секретируемой металлопротеиназы в клетках В.subtilis Аj73 npr-apr-amy, содержащих плазмиду рВАNP 463, устанавливают следующим образом. Клетки из отдельных клонов наносят микробиологической петлей на чашку Петри с твердым молочным агаром в виде точек или полос и инкубируют при 37^оС 18-24 ч. Вокруг выросшей массы клеток образуется прозрачная зона из гидролизованного казеина молока. Клетки исходного штамма В.subtilis Аj73 npr-apr-amy, не содержащие рВАNP 463, зон гидролиза казеина молока не образуют, так как не содержат собственных секретируемых протеаз. Определение активности металлопротеиназы. Активность металлопротеиназы в культуральной жидкости во время ферментации определяют по гидролизу 0,5%-ного азоказеина в 25 mM трис-НСl, рН 7,2, содержащем 0,1 mM CaCl₂ и 1 mM фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Реакционная смесь содержит 200 мкл 1%-ного раствора азоказеина, растворенного в буфере, содержащем 50 mM трис-НСl, рН 7,2, 0,2 mM CaCl₂, 2 mM ФМСФ и 200 мкл исследуемого образца (разведенного супернатанта культуральной жидкости бактерий). Пробы инкубируют при 37^оС 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 400 мкл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. После инкубации при 0^оС 30 мин смесь центрифугируют (12000 об/мин, 10 мин при комнатной температуре) и к 500 мкл супернатанта добавляют 500 мкл 0,5 N NaОН и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 440 нм. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое в условиях эксперимента за 1 мин увеличивает на 1 единицу оптическую плотность раствора, измеряемую при длине волны 440 нм. Активность считают, учитывая разведения. П р и м е р 2. Конструирование штамма - продуцента В.аmyloliquefaciens А-50 (рВАNP 463), ВКПМ В-4698. Трансформируют В. аmyloliquefaciens А-50 плазмидой pBАNP 463. Трансформацию протопластов клеток В. amyloliquеfaciens A-50 проводят следующим образом: 1 мл суспензии ночной культуры В.аmyloliquefaciens А-50 вносят в 9 мл питательного бульона РС и выращивают до титра 10 кл/мл. Клетки собирают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин, 20^оС), дважды промывают специальной средой SMMP, а затем ресуспендируют в среде SMMP, содержащей 100 мг/мл лизоцима, и инкубируют 30 мин при 42^оС. Образовавшиеся протопласты промывают средой SMMP с добавлением 0,1%-ного бычьего сывороточного альбумина и используют для трансформации. Плазмидную ДНК рВАNP 463 (2-10 мкг) инкубируют 2 мин при 0^оС с протопластами клеток В.аmyloliquefaciens А-50 и 22%-ным полиэтиленгликолем 6000, приготовленным на буфере SMMP. После десятикратного разведения средой SMMP c 0-1%-ным альбумином трансформированные протопласты высаживают центрифугированием (2000 об/мин, 10 мин, 20^оС), суспендируют в 1 мл той же среды, инкубируют 2 ч при 30^оС и высеивают на агаризованную среду DM3 с эритромицином (5 мкг/мл). Отбор трансформантов производят через 48 ч роста при 37^оС. П р и м е р 3. Получение металлопротеиназы с помощью рекомбинантного штамма В.amyloliquefaciens А-50 (рВАNP 463), ВКПМ В-4698. Накопление металлопротеиназы В.аmyloliquefaciens А-50 в культуральной жидкости плазмидного и бесплазмидного штаммов изучают при культивировании их в промышленных ферментационных средах следующего состава, г/л: картофельный крахмал, осахаренный α-амилазой, 160, кукурузный экстракт 8, белково-витаминный концентрат 4, (NH₄)₂HPО₄ 7,34, МgSО₄ ˙7Н₂О 0,5, КСl 1,5, СаСl₂ 0,1, рН 7,0. Штамм В.аmyloliquefaciens А-50 выращивают на среде без антибиотика, а штамм В.аmyloliquefaciens А-50 (рВАNP 463) - на среде, содержащей 10 мкг/мл эритромицина. Процесс ферментации проводят в ферментере емкостью 0,75 л при температуре 37^оС с подачей воздуха 1 объем на объем культуральной жидкости в диапазоне скорости вращения мешалки 400-700 об/мин. Активность фермента измеряют в ходе ферментации по методу, описанному выше. Данные по накоплению металлопротеиназы в культуральной жидкости В.аmyloliquefaciens А-50 и В. amyloliquеfaciens A-50 (рВАNP 463) во время ферментации суммируются в таблице. Из приведенных данных видно, что предлагаемый штамм - продуцент металлопротеинкиназы ≈ в 2 раза более продуктивен, чем штамм-прототип.

Формула изобретения

РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pBANP 464, КОДИРУЮЩАЯ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗУ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS A-50 И ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - ПРОДУЦЕНТ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ . 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBANP463, кодирующая металлопротеиназу Bacillus amyloliquefaciens A-50 размером 6,3 т.п.н. и содержащая: плазмидную ДНК pBA4 размером 4,4 т.п.н., в которой с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 удален в полилинкерной последовательности участок узнавания эндонуклеазы рестрикции EcoRI; B₈l 11 - B₈l 11 - фрагмент размером 1,9 т.п. н. с геном металлопротеиназы B.amyloliquefaciens А-50, гены: npr-ген, кодирующий синтез металлопротеиназы, emrC-ген, детерминирующий устойчивость клеток к эритромицину, par-область, обеспечивающая стабильное наследование плазмиды. 2. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens В-4698 - продуцент металлопротеиназы.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины заподдержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 29.12.2008

Дата публикации: 10.05.2011

---