Способ определения содержания плазминогена в биологической жидкости

 

Способ относится к медицинской биохимии и может быть использован в клиниколабораторной практике при диагностике и лечении заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза. Цель изобретения - ускорение способа. Для достижения цели биологическую жидкость разбавляют 0,05 М фосфатным буфером, затем на сорбенте лизин-агароза в соотношении сорбент - биологическая жидкость (1-2):1 проводят элюирование последовательно 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 7,4 и 0,01-0,1 М раствором Ј-аминокапроновой кислоты в указанном буфере, после чего спектрофотометрически определяют количество плазминогена в элюате. Способ позволяет также устранить зависимость от видовой специфичности обьекта исследования. 1 табл. w е

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 и 33-/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4680906/14 (22) 24.04.89 (46) 30.09.91. Бюл, N 36 (71) Институт биохимии им. А.В.Палладина и Киевский медицинский институт им. А.А.Богомольца (72) T.È,Ëåæåí, С.А.Кудинов, И,А.Палиенко и Т.Д. Никула (53) 612,11.1 (088.8) (56) Clemmensen 1. et al. Sem Arthr. апб

Rheumat, 1977, ч, 2, й. 7, р. 1354 — 1358. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕР)КАНИЯ ПЛАЗМИНОГЕНА В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ (57) Способ относится к медицинской биохимии и может быть использован в клиниколабораторной практике при диагностике и

Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть использовано в клинико-лабораторной практике при диагностике и лечении заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза.

Цель изобретения — ускорение способа и устранение зависимости от видовой спе- . цифичности объекта исследования.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Достоверность предложенного способа оценивают путем сравнительного определения количества плазминогена в модельной смеси.

В свободную от плазминогена плазму объемом 2 мл вносят известнбе количество плазминогена (см. таблицу). На колонку, заполненную 2 мл лизин-агарозы (концентрация иммобилизованного лизина 1 — 3 MM), наносят 2 мл цитратной плазмы крови, раз„, Ы„, 1681255 А1 лечении заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза. Цель изобретения — ускорение способа. Для достижения цели биологическую жидкость разбавляют 0,05 М фосфатным буфером, затем на сорбенте лизин-агароза в соотношении сорбент — биологическая жидкость (1 — 2):1 проводят элюирование последовательно 0,1 M натрий-фосфатным буфером.рН 7,4 и 0,01 — 0,1

M раствором е-аминокапроновой кислоты в указанном буфере, после чего спектрофотометрически определяют количество плазминогена в злюате. Способ позволяет также устранить зависимость от видовой специфичности объекта исследования. 1 табл. бавленной в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером, Белки плазмы элюируют 0,1

М натрий-фосфатным буфером до нулевого Ос, поглощения при 280 нм. Биоспецифически Q() связанный плазминоген элюируют 0,1 М раствором е, -аминокапроновой кислоты в

0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, до нулевого поглощения раствора при 280 нм.

Скорость нарастания и элюции — 60 мл/ч, Концентрацию плазминогена в плазме рассчитывают по формуле

ЛЕ Ч2 — ъ

Плазминоген, мг/мл — 17 0 / 10, 17,0 Ч1 где ЛЕ = E2BQ - E320 — разница величин экстинкции, измеренных при 280 и 320 нм (вычитание экстинкции при 320 HM представляет собой поправку на мутность);

17,0 — коэффициент экстинкции

Е jP 7зо для плаэминогена в слабощелочной среде при длине волны 280 нм;

1681255

25 мл, V> — объем взятой для анализа плазмы, Vz — объем спектрофотометрируемого раствора.

В нашем случае: ЛЕ =0,114; Ч1= 2 мл;

Ч2= 4 мл, Концентрация плазминогена

0,114 4

10 = 0,135 мгlмл плазмы.

Как видно из таблицы, весь внесенный в плазму плазминоген биоспецифически связывается с аффинным сорбентом и затем полностью элюируется я-аминокапро,новой кислотой при соблюдении и редложен н ых условий.

Пример 2. Определение и расчет проводят так же, как. в примере 1, но для определения берут 1 мл плазмы, а для элюирования плазминогена 0,01 M раствор яаминокапроновой кислоты в 0,05 М

Na-фосфатном буфере.

Ч1=; Vz.=.3 мл; ЛЕ =0,076.

Концентрация плазминогена

0076 3

° 10 = 0,135 мг/мл плазмы. Кроме того, содержание плазминогена определяют и в других биологических жидкостях.

Пример 3. 2 мл синовиальной жидкости больного ревматоидным артритом разводят в 2 раза 0,05 M натрий-фосфатным буфером, наносят на колонку, заполненную

2 мл лизин-агарозы, промывают 0,1 M натрий-фосфатным буфером, рН 7,4. Элюирование плаэминогена проводят 0,1 M раствором я-аминокапроновой кислоты в

0,05 M натрий-фосфатном буфере, рН 7,1, затем спектрофотометрируют, как в примерах 1 и2.

При этом ЛЕ = 0,062; Ч1 = 2 мл; Vz = 4 мл.

Концентрация плазминогена

0,062 4 17 2 10 = 0,073 мг/мл.

Концентрация плазминогена в синовиальной жидкости 16 больных ревматоидным артритом (в период обострения) составила

0,0668 0,0079 мг/мл, Пример 4. 1 мл цитратной плазмы крови мыши (пул 5 особей) разбавляют в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатним буфером, рН

7,4, и наносят на колонку, заполненную 2 мл лизин-агарозы. Элюирование проводят в два этапа: сначала промывка, а затем связанный плаэминоген элюируют 0,01 M раствором я-аминокапроновой кислоты (пример 1).

При этом ЛЕ = 0,055; Ч1 = 1 мл; Ч = 2

Концентрация плазминогена

0,055. 2

7 1 1 0 = 0,065 мг/мл.

Пример 5. 2 мл цитратной плазмы крови свиньи разбавляют в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером рН 7,4, и наносят на колонку., заполненную 2 мл лизин-агароэы. Последующие операции элюирования осуществляют, как описано в примере 1.

При этом ЛЕ = 0,102; V> = 2 мл; Vz = 4 мл.

Концентрация плазминогена — 10 = 0,120 мг/мл.

0,1Î2 4

Пример 6. 2 мл цитратной плазмы крови собаки разводят в 2 раза 0,05 M натрий-фосфатным буфером, рН 7,4, Последующие операции элюирования осуществляют, как описано в примере 1.

При этом hE = 0,063; V> =; Ч = 3 мл, Концентрация плаэминогена

0,063 3 х 10 = 0,056 мг/мл, Для доказательства достоверности и точности нового метода полученные результаты сравнивают с известными из литературных источников данными: количество плазминогена в плазме крови в норме составляет в соответствии с литературными данными 1,5 — 2„ММ или в среднем 0,158 мг/мл; 0,120 мг/мл, а у 12 больных ревматоидным артритом в плазме 0,172 и синовиальной жидкости 0,065 мг/мл при определении иммунохимическим способом.

Результаты, получаемые согласно предлагаемому способу, составляют в плазме крови для здорового человека 0,135 +0,0037 мгlмл, у больных ревматоидным артритом—

0,171 + 0,115, у пациентов болезнью Крона она колеблется от 0,080 — 0,120 мг/мл; в синовиальной жидкости количество плаэминогена у 16 больных ревматоидным артритом в период обострения составляет

0.0668 + 0,0079 мг/мл.

Использование нового метода определения плазминогена позволяет значительно сократить время анализа (1 ч по сравнению с 24 ч по способу-прототипу), При этом точность метода сохраняется достаточно высокой, что соответствует литературным данным и результатам экспериментального анализа и клинических исследований.

Использование способа позволяет также проводить определение плазминогена у различных животных не зависимо от видовой специфичности, 1681255

Формула изобретения

Составитель В. Митюшин

Редактор Л. Веселовская Техред M.Mîðleíòàë Корректор С. Шевкун

Заказ 3310 Тираж 389 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,-Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ определения содержания плазминогена в биологической жидкости путем разделения и детектирования продукта, о т- 5 л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения способа и устранения зависимости от видовой специфичности объекта исследования, биологическую жидкость разбавляют в два раза 0,05 М фосфатным буфером, проводят злюирование на сорбенте лизин-агароза в соотношении сорбент: биологическая жидкость (1 — 2):1. 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 7,4 и 0,01 — 0,1 M раствором

E-аминокапроновой кислоты в 0,05 M натрий-фосфатном буфере и в элюате определяют плазминоген спектрофотометрически.